Biophysikalische und pharmokologische Eigenschaften der erg-K+-Kanäle der Ratte

Mandel, Katja Birgitta

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Biophysikalische und pharmokologische Eigenschaften der erg-K+-Kanäle der Ratte

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In der Arbeit sollte geklärt werden, ob die unterschiedlichen elektrophysiologischen Eigenschaften des E-4031-sensitiven Stroms in verschiedenen Zellsystemen durch spezifische Faktoren zustande kommen, oder ob ein bisher unbekannter Kanal für deren Entstehung verantwortlich ist. Ausgegangen wurde hierbei von der Beschreibung einer neuen, langsamen Deaktivierungskinetik in laktotrophen und MMQ-Zellen (Schäfer et al., 1999; Lecchi et al., 2002) mit bisher ungeklärter Ursache. Alle in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse deuten auf die Existenz zellspezifischer Faktoren hin und sprechen gegen das Vorkommen eines neuen Kanals: Die langsam deaktivierende Stromkomponente konnte in allen MMQ-Zellen nachgewiesen werden. Die „Umwandlung“ des endogenen erg-Stroms mit Rückgang des langsamen und Zunahme des schnellen Deaktivierungsanteils bei Hyperpolarisation trat ohne eine Veränderung der maximalen Stromamplitude auf. Nach Injektion verschiedener erg-Kanäle in MMQ-Zellen ließ sich bei allen exprimierten Kanälen eine Veränderung der Deaktivierungskinetik beobachten. Die Spannungsabhängigkeit der Verfügbarkeit der langsamen Stromkomponente verschob sich dabei mit jedem exprimierten Kanal. Die besonderen kinetischen Eigenschaften des E-4031-sensitiven Stroms in MMQ-Zellen blieben auch nach Hemmung des endogenen erg1 mit siRNA erhalten, wobei auch die Amplitude der langsamen Komponente signifikant reduziert war. Bei der Suche nach der Lokalisation der Faktoren war das Zytoplasma als Aufenthaltsort bereits weitestgehend ausgeschlossen (Buhk, 2004) und eine Assoziation der Faktoren mit der Membran schien wahrscheinlich (Schäfer et al., 1999). Durch den Einsatz verschiedener Splicevarianten und Deletionsmutanten des HERG konnten der distale C-Terminus und der N-Terminus als Interaktionsstelle für mögliche Faktoren, die verantwortlich für die langsame Komponente der Deaktivierung sind, ausgegrenzt werden. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde die Wirkung zweier Fluorochinolonantibiotika auf erg-Kanäle überprüft. Eine erg-blockierende Wirkung von Ciprofloxacin konnte in dieser Arbeit bis zu einer Konzentration von 3 mmol/l nicht nachgewiesen werden. Enrofloxacin reduzierte den erg-Auswärtsstroms in MMQ-Zellen mit einem IC50-Wert von 1,18 mmol/l. Übertragen auf die Verhältnisse am Herzen, wo der Auswärtsstrom an der Repolarisation des Herzaktionspotentials beteiligt ist, könnte Enrofloxacin somit durch Blockade des IKr eine Verlängerung der QT-Zeit bewirken, was in lebensbedrohlichen Arrhythmien resultieren kann. In therapeutisch relevanter Dosierung konnte in der vorliegenden Arbeit aber kein hemmender Effekt nachgewiesen werden. Die ausschließliche, ordnungsgemäße Behandlung von Tieren mit Enrofloxacin sollte deshalb nicht bedenklich sein. Dennoch ist vor möglichen cardialen Nebenwirkungen zu warnen, gerade wenn Enrofloxacin in Kombination mit anderen Arzneimitteln, die ebenfalls eine QT-Verlängerung bewirken, verabreicht wird. Vorsicht ist auch bei der Therapie von Risikopatienten geboten, zu denen solche mit Elektrolytstörungen oder bereits bestehenden cardialen Erkrankungen zählen. Die Zahl der Arzneimittel und Risikofaktoren, die beim Menschen in Zusammenhang mit dem LQTS bekannt sind, rechtfertigen weitere Untersuchung dieses Syndroms beim Tier. Arzneimittel, die unerwartet den IKr blockieren und das QT-Intervall verlängern, können lebensbedrohlich für Mensch und Tier sein, kostspielige Behandlungen nach sich ziehen, und die Zulassung des betroffenen Arzneimittels zum Markt verhindern. Im Hinblick auf die Entwicklung neuer Arzneimittel ist zu bedenken, dass, trotz standardisierter Patch-clamp-Technik durch die verschiedenen experimentell genutzten Expressionssysteme, die Temperatur und die verwendeten Protokolle Diskrepanzen in der Affinität zum HERG-Kanal bestehen (vergl. Kapitel 9; Tab. 2). Gefordert sind deshalb standardisierte HERG-Kanal-IC 50 Tests und in silico Modelle für die Überprüfung nicht nur human- sondern auch tiermedizinischer Wirkstoffe.

The present study should clarify whether the diverse electrophysiological properties of the E-4031-sensitive current in different cell systems are determined by cell-specific factors or by an so far unknown erg channel subunit. The question of this work arose because of the discription of the unexplained mechanism of slowly deactivating erg currents in lactotrope cells (Schäfer et al., 1999; Lecchi et al., 2002). The following results suggest the existence of cell-specific factors and argue against the presence of a new channel: The slowly deactivating component of the erg current could be detected in all lactotrope MMQ-cells. The endogenous erg current could be „conversed“ by hyperpolarizing the cells from a slowly to a fast deactivating current without apparent change of the maximal current amplitude. After injection of cDNA of different erg channel subunits in MMQ cells a slowly deactivating current component emerged in all expressed channels. The voltage dependence of the availability of the slow current component was shifted by the expressed channel subunits. After suppression of endogenous erg1 channel subunits with siRNA the special kinetic properties of the E-4031-sensitive current in MMQ-cells remained to the same degree, whereas the amplitude of the slow current component was reduced too. Previous results largely excluded the involvement of cytoplasmic cell-specific factors (Buhk, 2004). Therefore, the earlier suggested association of the factors with the membrane became more likely (Schäfer et al., 1999). By testing different splice variants and deletion mutants of the HERG channel, the distal C-terminus and the N-terminus could be excluded as the interaction site for putative factors, responsible for the slow deactivation. In the second part of the present work the effect of two different fluorochinolone antibiotics on erg currents was investigated. In this work 3 mmol/l ciprofloxacin had no erg-blocking effect. Enrofloxacin reduced the erg outward current in MMQ-cells with an IC50 value of 1,18 mmol/l. Applied to the conditions in the heart, where the erg outward current contributes as Ikr to the repolarisation of action-potential, enrofloxacin could prolong the QT-interval what can result in life-threatening arrhythmias. In therapeutic doses an inhibitory effect on erg currents was not found in this study. An exclusive, adequate therapy of pets with enrofloxacin should therefore be safe. Anyhow, it must be warned of adverse cardiac effects, especially if enrofloxacin is administered with other drugs which are known to prolong the QT-interval. Caution is also demanded during medication of risk patients, those with electrolyte interferences or pre-existing cardiac diseases. The number of drugs and risk factors which are connected with the long QT-syndrome in human warrants further analysis of this syndrome in animals. Use of drugs that block Ikr and prolong the QT interval can be life-threatening for man and domestic animals and can result in expensive treatments, which can prevent the admission of the drug to the market. With regard to the development of new drugs discrepancies in the affinity to HERG channels in different expression systems, different temperature and potentials have to be considered despite standardised patch-clamp techniques (chapter 9; Tab. 2). It is therefore postulated that standardised HERG channel-IC50 tests and in silico models should also be conducted for testing medical agents used for animals.