Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular genetic analysis of canine congenital sensorineural deafness in Dalmatian dogs

Mieskes, Katharina

The objective of the present study was to localize the gene or genomic region that is involved in the development of canine congenital sensorineural deafness (CCSD) in Dalmatian dogs. In man as in different dog breeds deafness is an often diagnosed disorder with the Dalmatian dog showing the highest incidence. Many genetic disorders in humans and domestic dogs (Canis familiaris) demonstrate a high level of clinical and molecular similarity. Altogether 39 genes have already been found causative for sensorineural non-syndromic hearing impairment in humans. Out of this 39 deafness causing genes a total of 32 candidate genes were selected for canine congenital deafness, which showed an appropriate clinical and histological disease pattern in comparison to deafness in Dalmatians dogs. An existing set of 43 microsatllite markers for in total 24 candidate genes were used for a non-parametric linkage analysis, among them the claudin-14 (CLDN14) gene on canine chromosome (CFA) 31 and the myosin, heavy polypeptide 9 (MYH9) gene on CFA10. The gap junction protein, alpha 1 (GJA1) gene on CFA1 was also considered as a candidate gene for CCSD and thus GJA1-associated microsatellites were part of the existing set. Recently it turned out, that GJA1 is not responsible for human sensorineural non-syndromic deafness, but for a human syndromic disorder that can be related with conductive deafness. In the last few years more human deafness genes have been identified, among them eight genes that were considered as appropriate candidates for CCSD. For these eight genes a total of 21 SNPs were newly developed and used for non-parametric linkage and association analyses. The used microsatellite and SNP markers derived either from a partial sequence analysis of BAC clones each containing a different candidate gene, or from sequences deposited in the current dog genome assembly (Boxer genome assembly 2.1) of the NCBI GenBank. We found significant linkage to markers associated to CLDN14 on CFA31, MYH9 on CFA10 and GJA1 on CFA1. To substantiate the linkage we searched for sequence variations within these three genes. SNPs found in intronic sequences of either gene were included in the linkage analyses. Sequence analysis neither revealed a causative mutation nor significant linkage disequilibrium of SNP markers with CCSD. Subsequently, CFA1, 10 and 31 were scanned completely with microsatellite markers derived from the NCBI database with the purpose to see if other regions on this three chromosomes harbour a gene that is involved in the development of CCSD. The analyses of SNPs and more microsatellite markers on CFA1 revealed no significant linkage to CCSD. Thus, it is unlikely that the canine chromosome and the GJA1 gene are responsible for the CCSD phenoptype. As deafness in dogs, especially in Dalmatians, is almost exclusively caused by sensorineural non-syndromic forms, the GJA1 gene should not be considered as a candidate gene for CCSD anymore. On CFA10 we could exclude MYH9 for being causal for deafness, but by adding more microsatellites covering CFA10 completely we found significant linkage to the CCSD phenotype in the region distal of MYH9. Hence, new SNP-markers for fine mapping the region spanning 36 to 48 Mb were developed by sequence analyses of different Dalmatian dogs. The search for SNPs was carried out on genomic sequences of genes located in the significantly linked region. The sequences of these genomic sequences were derived from the NCBI GenBank. The SNPs confirmed the linkage and narrowed the region harbouring a causative CCSD gene down to 5 Mb spanning from 39 to 44 Mb. After scanning CFA31 we could not exclude CLDN14 for being responsible for the CCSD phenotype as microsatellite markers associated to CLDN14 indicated linkage. However, to clarify the importance of CLDN14 in the CCSD phenotype, more SNPs have to be developed within the CLDN14 gene as well as in its flanking regions with the aim to find linkage disequilibrium for SNP markers.

Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die für die kongenitale sensorineurale Taubheit beim Dalmatiner kausalen Gene, bzw. Genorte zu lokaliesieren. Die kongenitale sensorineurale Taubheit ist eine Erkrankung, von der viele Säugetierspezies betroffen sind. Beim Hund werden über 54 verschiedene Rassen beschrieben, bei welchen ein kongenitaler Hörverlust gehäuft auftritt. In zahlreichen europäischen und amerikanischen Studien weisen hierbei die Dalmatiner mit 16,5-30% die höchste Taubheitsinzidenz auf. Die histologischen Veränderungen im Innenohr werden im Allgemeinen ähnlich wie beim Menschen als cochleosacculär beschrieben. Die Degenerationen im Innenohr schreiten bei betroffenen Tieren mit zunehmendem Alter fort und führen normalerweise in einem Alter von drei bis vier Wochen, spätestens aber in einem Alter von etwa vier Monaten zu einem vollständigen, ein- oder beidseitigen Hörverlust. Bisher wurden insgesamt 39 Gene identifiziert, die ursächlich für verschiedene Formen der sensorineuralen nicht-syndromischen Taubheit beim Menschen sind. Von den 39 Taubheitsverursachenden Genen beim Menschen wurden insgesamt 32 als Kandidatengene für die canine congenitale sensorineurale Taubheit (CCSD) beim Dalmatiner ausgewählt. Diese 32 Kandidatengene wurden mit Hilfe von genetischen Marker (Mikrosatelliten und SNPs) analysiert. Nicht-parametrische Kopplungsstudien und Assoziationsstudien wurden durchgeführt. Wir fanden signifikante Kopplung zu genetischen Markern assoziiert mit CLDN14 auf dem Hunde- Chromosom (CFA) 31, MYH9 auf CFA10 und GJA1 auf CFA1. Die höchsten Teststatistiken zeigte die Kopplungsstudie in einzelnen Familien für unterschiedliche Gene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Erbgang der nicht-syndromischen Taubheit beim Dalmatiner vermutlich ebenso heterogen ist, wie er sich beim Menschen darstellt. Um die Teststatistiken abzusichern, wurde nach Sequenzunterschieden in den drei Genen CLDN14, MYH9 und GJA1 gesucht. Die Sequenzanalysen zeigten weder eine kausale Mutation noch konnte ein signifikantes Kopplungsungleichgewicht der SNP Marker mit CCSD gefunden werden. Daraufhin wurden CFA1, CFA10 und CFA31 komplett mit Hilfe von Mikrosatelliten Markern abgedeckt, um so abzuklären, ob andere Chromosomenbereiche auf diesen drei Chromosomen ein Gen beinhalten, welches an der Entstehung der caninen Taubheit verantwortlich ist. Die nicht-parametrische Kopplungsanalyse mit Hilfe von 27 Mikrosatelliten Markern auf CFA1 zeigte keine signifikanten Teststatistiken. Es ist daher unwahrscheinlich, dass auf CFA1 Gene für die Entwicklung von CCSD in den untersuchten Dalmatinerfamilien verantwortlich sind. Auf CFA10 wurde durch eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse von 27 Mikrosatelliten eine 12 Mb umfassende genomische Region mit einer signifikanten Kopplung zur CCSD identifiziert. Zur weiteren Feinkartierung wurden 26 neue SNPs mit einem durchschnittlichen Abstand von 0.3 Mb  für diesen Bereich entwickelt. Die SNPs waren größtenteils informativ im vorliegenden Familienmaterial und bestätigten in einer folgenden Kopplungsanalyse die Lokalisation auf CFA10 deutlich. Weiterhin konnte die gekoppelte Region auf einem 5 Mb umfassenden Bereich von 39 bis 44 Mb eingegrenzt werden. Es ist wahrscheinlich, dass die identifizierte CCSD Region ein Gen beinhaltet, welches auf die Entstehung der caninen kongenitalen Taubheit einwirkt. Es ist notwendig, mehr SNPs zu entwickeln, um das taubheitsverursachende Gen zu lokalisieren oder einen eindeutig assoziierten SNP zu identifizieren. Auf CFA31 wurde durch eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse von Mikrosatelliten eine Kopplung eines CLDN14-benachbarten Markers mit der sensorineuralen Taubheit beim Dalmatiner festgestellt. Da bislang keine funktionelle Mutation in der kodierenden Region von CLDN14 gefunden wurde, ist es für eine eindeutige Aussage über die Rolle des CLDN14 Gens im Entstehungsprozess der kongenitalen sensorineuralen Taubheit beim Dalmatiner notwendig, noch weitere Marker im CLDN14 Gen, sowie seiner näheren Umgebung zu entwickeln und zu analysieren. Da keine weitere Kopplung zu einem Mikrosatelliten distal oder proximal des CLDN14 Gen festgestellt werden konnte, ist es wahrscheinlich, dass entweder das CLDN14 Gen oder ein Gen in seiner näheren Umgebung für die Entwicklung der sensorineuralen Taubheit in den untersuchten Dalmatinerfamilien verantwortlich ist.

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Mieskes, Katharina: Molecular genetic analysis of canine congenital sensorineural deafness in Dalmatian dogs. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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