Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Identifizierung, Expression und Charakterisierung der Protein Disulfid Isomerase von Ancylostoma caninum

Pohl, Stefanie

It was the aim of this study to characterise the protein disulfide isomerase of Ancylostoma caninum, the hookworm of dogs. PDI is a potential vaccine antigen against ancylostomosis. The cDNA- and genomic DNA-sequence of the PDI gene was identified. Furthermore the PDI was expressed in a prokaryotic expression system and analysed by bioinformatical data.   The identification of the cDNA of the PDI gene started with the discovery of a homologue part of the sequence, which was found in different clones generated in an earlier study. For generating the complete cDNA-sequence a 5´- and 3´-Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) were used. While the 5´-end of the sequence could be identified by 5´-RACE, the exploration of the 3´-end required two additional polymerase chain reactions (PCRs). The cDNA of the PDI gene consists of 1784 basepairs (bp). The open reading frame (ORF) contains 1482 bp that encodes for a protein consisting of 493 amino acids. Two thioredoxin domains were found in the amino acid sequence of PDI. Each of them contains 106 bp and the highly conserved active sites of these domains are responsible for the protein disulfide isomerase activity. The genomic DNA of the PDI gene was identified by seven different PCRs. It consists of 2914 bp. A comparison with the cDNA showed the locations of five exons and four introns. Furthermore the PDI was expressed by a prokaryotic expression system. The coding cDNA-sequence was cloned into an entry-vector and the developed entry-clone was recombined with a destination-vector in a LR-recombination reaction. With isopropylthiogalactoside (IPTG) the expression-clone was induced for production of the recombinant protein. By SDS-PAGE the PDI was detected as a protein band at approximately 65 kDa. Bioinformatical data were received by software tools of the ExPASy server (Swiss Institute of Bioinformatics) and the PredictProtein server (European Molecular Biology Laboratory). Programs of the ExPASy server predicted a signal peptide, one potential O-GalNac-glycosylation site of a threonine residue and potential phosphorylation sites of twelve serine, eight threonine and four tyrosine residues in the amino acid sequence of PDI. In addition physicochemical parameters were given. Programs of the PredictProtein server found several motifs, low-complexity regions and domain families. By alignments identities to PDIs other organisms were shown. Methods for prediction of protein structure classified the PDI as „mixed“ protein, gave information about the solvent accessibility and globularity of PDI as well as about structural ambivalent segments.

Ziel dieser Arbeit war es, die Protein Disulfid Isomerase (PDI) von Ancylostoma caninum, dem Hakenwurm des Hundes, zu charakterisieren. Diese stellt ein mögliches Antigen zur Vakzinierung gegen die Ancylostomose dar. Es wurde die cDNA- sowie die genomische DNA-Sequenz identifiziert, die PDI wurde als rekombinantes Protein in einem prokaryotischen Expressionssystem produziert und durch bioinformatische Methoden analysiert.   Den Anfang der Identifizierung der cDNA des PDI-Gens stellte die Analyse einer homologen Teilsequenz verschiedener Klone dar, die im Rahmen einer vorhergehenden Arbeit erzeugt wurden. Zur Generierung der vollständigen cDNA-Sequenz wurde mit genspezifischen Primern eine 5´- und eine 3´-Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) durchgeführt. Während das 5´-Ende durch die RACE identifiziert werden konnte, waren für die Aufklärung der 3´-Sequenz zwei weitere Polymerasekettenreaktionen (PCRs) notwendig. Die Länge der cDNA beträgt 1784 Basenpaare (bp). Der offene Leserahmen (ORF) umfasst 1482 bp und kodiert für ein Protein, das aus 493 Aminosäuren (AS) besteht. In der AS-Sequenz der PDI wurden zwei Thioredoxin-Domänen aufgefunden, die aus jeweils 106 bp bestehen. Dabei handelt es sich um hoch konservierte Sequenzen, die in den PDIs anderer Organismen ebenfalls enthalten sind. Ihre aktiven Seiten sind für die Protein-Disulfid-Isomerase-Aktivität verantwortlich. Die genomische DNA des PDI-Gens wurde durch sieben verschiedene PCRs entschlüsselt. Ihre Länge beträgt 2914 bp. Ein Sequenzvergleich zu der cDNA zeigte die Lokalisationen der fünf Exons und vier Introns auf. Zudem wurde die PDI in einem prokaryotischen Expressionssystem exprimiert. Dafür wurde die kodierende cDNA-Sequenz in einen Entry-Vektor kloniert. Der daraus entstandene Entry-Klon wurde in einer LR-Rekombinationsreaktion mit einem Destinations-Vektor rekombiniert. Der so hergestellte Expressions-Klon wurde mit Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert, wodurch dieser das rekombinante Protein produzierte. In einer Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) mit der rekombinanten PDI stellte sich eine Bande bei ca. 65 kDa dar. Bioinformatische Informationen zu der PDI ließen sich über Computer-Methoden des ExPASy-servers (Swiss Institute of Bioinformatics) und des PredictProtein-servers (European Molecular Biology Laboratory) aufzeigen. Durch Programme des ExPASy-servers wurde berechnet, dass die PDI ein Signalpeptid besitzt, dass ein Threonin-Rest eine potentielle O-GalNac-Glykosylierungsstelle aufweist und dass zwölf Serin-, acht Threonin- und vier Tyrosin-Reste potentielle Phosphorylierungsstellen tragen. Zusätzlich wurden errechnete physiko-chemische Parameter angegeben. Programme des PredictProtein-servers haben in der PDI verschiedene Motive, Segmente geringer Komplexität und Domänen-Familien aufgefunden. Weiterhin konnten durch Alignment-Programme Identitäten zu PDIs anderer Organismen aufgezeigt werden. Strukturvorhersage-Programme klassifizierten die PDI als „gemischtes“ Protein, gaben Informationen zur Lösungsmittel-Zugänglichkeit der Aminosäure-Reste sowie zur Globularität der PDI und zeigten strukturell ambivalente Segmente auf.

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Pohl, Stefanie: Identifizierung, Expression und Charakterisierung der Protein Disulfid Isomerase von Ancylostoma caninum. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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