Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung von Verfahren zum direkten Nachweis von M. avium subsp. paratuberculosis aus Rohmilch

Stratmann, Janin

M. avium subspecies paratuberculosis (MAP) is the etiological agent of paratuberculosis (Johne's disease), a chronic granulomatous enteritis of ruminants occurring worldwide and leading to growing economic losses. The pathogen is shed intermittently during subclinical infection with faeces and milk, with clinical signs developing after a prolonged incubation period of up to five years. To date no diagnostic tests are available that provide a sensitive and rapid diagnostic test system for the detection of MAP in milk. In this study the MAP-specific peptide aMptD, which was originally isolated from a phage-peptide library,. was used as a basic reagent for a peptide-mediated capture of the pathogen, followed by a MAP-specific PCR based on the insertion element ISMav2. Peptide-mediated capture PCR facilitated the detection of as few as 100 MAP bacteria per millilitre in spiked milk samples, and the reproducible detection of MAP in milk samples from infected cows and seropositive herds. As the test is based solely on defined reagents, it might be suitable for routine testing of pooled milk samples. Furthermore it was possible to demonstrate that the results of the capture-PCR correlate with the results of a bulk milk ELISA. Therefore, a combination of the two independent test systems in a two-step program could facilitate control and surveillance of paratuberculosis in dairy herds at reasonable cost, thereby reducing the contamination of the environment and of dairy products.

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose bzw. Johne‘schen Erkrankung, einer weltweit auftretenden chronisch granulomatösen Enteritis bei Wiederkäuern, die zu bedeutenden wirtschaftlichen Verlusten führt. Der Erreger wird in der subklinischen Phase der Erkrankung intermittierend mit dem Kot und in der Milch ausgeschieden. Das klinische Bild der Erkrankung zeigt sich aber meist erst nach einer sehr langen Inkubationszeit von bis zu fünf Jahren. Bis heute ist kein diagnostischer Test erhältlich, der eine schnelle und sensitive Diagnose von MAP in Milch ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurde das aus einer Phagen-Peptid Bibliothek isolierte MAP-spezifische und hoch affine Peptid aMptD verwendet, um den Erreger mittels Peptid-vermittelter „Capture“ PCR, basierend auf dem MAP spezifischen Element ISMav2, in Milch nachzuweisen. Die Peptid aMptD-vermittelte „Capture“-PCR ermöglichte neben dem Nachweis von nur 100 Erregern pro Milliliter künstlich kontaminierter Milch auch den reproduzierbaren Erregernachweis in Milchproben von infizierten Kühen und in Sammelmilchproben von serologisch positiven Herden. Da die Peptid-vermittelte „Capture“-PCR ausschließlich auf standardisierten Reagenzien basiert, könnte diese für die routinemäßige Untersuchung von Sammelmilchproben eingesetzt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Ergebnisse der „Capture“-PCR mit den Ergebnissen eines Sammelmilch-ELISA korrelieren. Der Einsatz dieser beiden unabhängigen Testsysteme in einem Zwei-Stufen Programm würde die kostengünstige Kontrolle und Überwachung der Paratuberkulose in Milchviehbeständen ermöglichen und so den Erregereintrag in die Umwelt und das Lebensmittel Milch stark reduzieren.

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Stratmann, Janin: Entwicklung von Verfahren zum direkten Nachweis von M. avium subsp. paratuberculosis aus Rohmilch. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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