Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zu trophischen und protektiven Effekten neurotropher Faktoren (Brain-derived neurotrophic factor, Glial cell line-derived neurotrophic factor), des Glukocorticoids Dexamethason sowie elektrischer Stimulation auf kultivierte Spiralganglienzellen der Ratte

Wefstaedt, Patrick

An optimized cochlear implant prosthesis therapy of deaf patients is dependend on a preferably great number of vital spiral ganglion cells. In this context various studies have been demonstrated that neurotrophic factors like GDNF and BDNF as well as electrical stimulation are promising therapeutic options to improve the survival of spiral ganglion cells and partly to induce an enhanced outgrowth of spiral ganglion neurites. With regard to their anti-proliferative and anti-inflammatoric effects glucocorticoids like dexamethasone are potentially suitable to reduce unintended side-effects of electrode implantation such as growth of connective tissue around the electrode. Terefore glucocorticoids are promising agents to improve the nerve-electrode contact when locally applied into the inner ear. So far it is unknown which concentrations and combinations of the mentioned factors are optimal with respect to an improved spiral ganglion cell survival and neurite outgrowth in vivo and in vitro.   Therefore, the main emphasis of this study was put on following questions:   1. Spiral ganglion cells were microscopically dissected from 3-5 day old rats, mechanically/ encymatically dissociated and cultivated for 48 h. By application of the neurotrophic factors BDNF, GDNF and the glucocorticoid dexamethasone in different concentrations (25, 50, 100 ng/ml) and combinations (100 ng/ml) possible toxic, protective and trophic effects were investigated. After the cultivation period cells were fixated and immunocytochemically stained (avidin biotin complex method; primary antibody: anti-neurofilament 200 kD) in order to count vital spiral ganglion cells and measure outgrowing neurites afterwards. A BDNF concentration of 50 ng/ml was demonstrated to be maximum effective for an enhanced spiral ganglion cell survival as well as neurite outgrowth in vitro. In case of GDNF a concentration of 100 ng/ml could be identified to be effective for an increased spiral ganglion cell survival, whereas a combination of BDNF and GDNF (100 ng/ml) exerts no additional protective or trophic effect on spiral ganglion cells. Dexamethasone had no influence on spiral ganglion cell survival or neurite outgrowth in all concentrations investigated. A combination of dexamethasone with BDNF and GDNF neither reduced nor enhanced the protective and trophic effects of the neurotrophic factors on spiral ganglion cells.   2. The question of a hypothetically altered gene and proteine expression of the neurotrophic factors BDNF and GDNF and their receptors in cultivated spiral ganglion cells with addition of the mentionend neurotrophic factors (100 ng/ml) was investigated using semiquantitative RT-PCR and indirect immunofluorescence. A proteine expression of the receptors GFRα-1, Ret und TrkB could be detected in the spiral ganglion cell soma after a cultivation period of 4 and 48 h in all investigated conditions. Additionally the TrkB receptor could be detected on outgrowing neurites after 48 h in vitro in the BDNF stimulated condition. Following RT-PCR gene expression of BDNF, GDNF and their correlating receptors could be detected in spiral ganglion cells in all investigated culture conditions. A relative comparison of the gene expression in spiral ganglion cells was demonstrated to be difficult to accomplish because of a variing number of spiral ganglion cells in the different culture conditions.   3. Using a newly developed and evaluated (pH, temperature, cytotoxicity on electrially stimulated fibroblasts) cell culture device for the electrical stimulation of spiral ganglion cells suitable stimulation parameters for a maximum spiral ganglion cell survival and neurite outgrowth were tested as single stimulation and in combination with the application of the neurotrophic factor BDNF (100 ng/ml). As a result of inital experiments (regarding pH and temperature behaviour in the culture medium under electrical stimulation) and flowcytometric investigation of electrically stimulated and propidiumiodide stained NHDF-fibroblasts, an appliable maximum voltage of 40 V was identified to be suitable for the cultivation of spiral ganglion cells in electrical fields. A single electrical stimulation at voltages of 6 and 30 V was demonstrated to be not effective for an enhanced spiral ganglion cell survival or neurite outgrowth under the applied stimulation parameters (48 h, biphasic rectangular pulses, 50 Hz, 1 s active, 19 s passive) when compared to an unstimulated control group. In contrast survival rates of combined electrically and BDNF stimulated spiral ganglion cells could be demonstrated to be significantly increased in comparison to the control group and tendencially but not significantly enhanced when compared with the survival rates attained by single BDNF application.   Considering the demonstrated facts it could be concluded that dexamethasone exerts no toxic effects on cultivated spiral ganglion cells. By reason of its anti-proliferative and anti-inflammatoric effects dexamethasone is an interesting agent which should be looked at further in vivo in context of an optimized cochlear implant supply. For the neurotrophic factors BDNF and GDNF optimal in vitro concentrations could be identified and protective and in case of BDNF trophic effects on spiral ganglion cells could be approved. A combined application of both factors caused no additional advantage when compared with single BDNF and GDNF application. The developed cell culture device for an electrical stimulation of cultivated spiral ganglion cells provides the possibility to test and identify interesting parameters of a patterned electrical stimulation before in vivo experiments were carried out.

Die Optimierung der Therapie von ertaubten Patienten mit künstlichen Innenohrprothesen (Cochlea-Implantaten, CI) setzt auf eine möglichst große Anzahl vitaler Spiralganglienzellen. In verschiedenen Studien konnte demonstriert werden, dass neurotrophe Faktoren wie GDNF und BDNF und auch eine elektrische Stimulation vielversprechende Therapieoptionen für einen verbesserten Spiralganglienzellerhalt und z.T ein verbessertes Auswachsverhalten von Spiralganglienzellneuriten darstellen. Glukocorticoide wie Dexamethason sind aufgrund ihrer bekannten anti-inflammatorischen und anti-proliferativen Eigenschaften potentiell geeignet bei lokaler Applikation ins Innenohr unerwünschte Bindegewebsbildungen im Bereich der implantierten CI-Elektoden zu minimieren und damit für eine verbesserte Nerv-Elektroden-Kontaktierung zu sorgen. Welche Konzentrationen und Kombinationen der genannten Faktoren hinsichtlich eines verstärkten Spiralganglienzellüberlebens und Neuritenauswachsverhaltens in vivo und in vitro optimal sind, ist bisher ebenso unzureichend untersucht wie optimale Parameter einer elektrischen Stimulation.   Aus diesen Sachverhalten ergaben sich für die vorliegende Arbeit folgende Schwerpunkte:   1. Mittels mikroskopischer Dissektion gewonnene und enzymatisch/mechanisch vereinzelte Spiralganglienzellen von 3-5 Tage alten Ratten wurden in vitro (48 h) auf mögliche toxische, protektive und trophische Effekte der neurotrophen Faktoren BDNF, GDNF sowie des Glukocorticoids Dexamethason bei alleiniger Applikation (25, 50, 100 ng/ml) und in Kombination miteinander (je 100 ng/ml) untersucht. Nach Abschluss des Kultivierungsszeitraumes wurden die Zellen fixiert und die Spiralganglienzellen immuncytochemisch markiert (Avidin-Biotin-Complex-Methode; 1. Antikörper: Anti-Neurofilament 200 kD). Die vitalen Zellen wurden ausgezählt und ausgesprosste Spiralganglienzellneuriten vermessen. Eine BDNF-Konzentration von 50 ng/ml erwies sich als maximal effektiv sowohl hinsichtlich eines gesteigerten Spiralganglienzellüberlebens als auch eines verstärkten Neuritenauswachsverhaltens. Für GDNF konnte eine Konzentration von 100 ng/ml als maximal effektiv im Bezug auf ein gesteigertes Spiralganglienzellüberleben demonstriert werden, wohingegen eine Kombination beider Faktoren (100 ng/ml) keinen zusätzlichen spiralganglienzellprotektiven oder trophischen Effekt erbrachte. Dexamethason zeigte in allen untersuchten Konzentrationen keinen Einfluss im Sinne eines verstärkten oder verminderten Spiralganglienzellüberlebens. Bei kombinierter Applikation von Dexamethason mit GDNF und BDNF blieben die protektiven und auch trophischen Effekte der genannten Faktoren unbeeinträchtigt.   2. Mittels RT-PCR und indirektem Immunfluoreszenztest wurde die Fragestellung einer hypothetisch veränderten Gen- und Proteinexpression der neurotrophen Faktoren BDNF und GDNF und ihrer Rezeptoren in in Anwesenheit der genannten Faktoren kultivierten Spiralganglienzellen untersucht. Die Rezeptoren GFRα-1, Ret und TrkB ließen sich auf Proteinebene im Bereich des Spiralganglienzellsomas nachweisen, der TrkB-Rezeptor konnte zusätzlich auch auf ausgesprossten Neuriten nachgewiesen werden. Nach RT-PCR-Versuchen konnte auch eine Genexpression von BDNF und GDNF sowie ihrer entsprechenden Rezeptoren in kultivierten Spiralganglienzellen nachgewiesen werden. Ein relativer Vergleich der Genexpression zwischen den verschiedenen Kulturkonditionen erwies sich, aufgrund der variablen Anzahl Spiralganglienzellen in der Gesamtzellpopulation der verschiedenen Konditionen, als schwer durchführbar.   3. Unter Verwendung einer neu entwickelten und evaluierten (pH, Temperatur, Zytotoxizität auf Fibroblasten) Zellkulturkammer zur elektrischen Stimulation kultivierter Spiralganglienzellen wurden geeignete Stimulationsparameter hinsichtlich eines verbesserten Spiralganglienzellüberlebens und Neuritenauswachsverhaltens alleine und in Kombination mit dem neurotrophen Faktor BDNF untersucht. Aufgrund der Ergebnisse aus Vorversuchen hinsichtlich pH- und Temperaturverhalten im Kulturmedium unter elektrischer Stimulation und durchflusszytometrischer Untersuchungen an mit Propidiumiodid gefärbten und zuvor elektrisch stimuliert kultivierten NHDF-Fibroblasten konnte ein applizierbarer Spannungsbereich von maximal 40 V als geeignet für die elektrische Stimulation von Spiralganglienzellen identifiziert werden. Eine alleinige elektrische Stimulation bei Spannungen von 6 und 30 V bewirkte unter den verwendeten Reizparametern (48 h, biphasische Rechteckpulse, 50 Hz, 1 s aktiv, 19 s passiv) hinsichtlich des Spiralganglienzellüberlebens und Neuritenauswachsverhaltens keine signifikante Verbesserung gegenüber der Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu lagen die Spiralganglienzellüberlebensraten in der elektrisch stimulierten und mit BDNF-Applikation kombinierten Kondition über den Überlebensraten, die durch die alleinige Applikation von BDNF erzielt werden konnten. Diese Unterschiede erwiesen sich jedoch als nicht signifikant.   Zusammenfassend lässt sich nach den hier dargestellten Ergebnissen feststellen, dass Dexamethason keine toxischen Effekte auf kultivierte Spiralganglienzellen ausübt. Aufgrund dieser Eigenschaft und der anti-inflammatorischen und anti-proliferativen Wirkungsweise erscheint Dexamethason als eine interessante Substanz, die mit der Zielsetzung einer optimierten CI-Versorgung näher in vivo untersucht werden sollte. Für die neurotrophen Faktoren BDNF und GDNF konnten optimale Konzentrationen bestimmt und ihr protektiver und im Falle von BDNF trophischer Effekt auf kultivierte Spiralganglienzellen bestätigt werden. Eine kombinierte Applikation beider Substanzen bietet nach den hier vorgestellten Untersuchungen keinen zusätzlichen Vorteil gegenüber der Applikation der Einzelfaktoren. Mit dem entwickelten Zellkultursystem zur Untersuchung der Effekte einer elektrischen Stimulation auf kultivierte Spiralganglienzellen steht ein Versuchssetup zu Verfügung, dass die Untersuchung verschiedener Parameter einer elektrischen Stimulation bereits im Vorfeld der Durchführung von Tierversuche ermöglicht.

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Wefstaedt, Patrick: Untersuchungen zu trophischen und protektiven Effekten neurotropher Faktoren (Brain-derived neurotrophic factor, Glial cell line-derived neurotrophic factor), des Glukocorticoids Dexamethason sowie elektrischer Stimulation auf kultivierte Spiralganglienzellen der Ratte. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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