Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Mechanismen der Mykobakterien-abhängigen Modulation von Makrophagen und deren Auswirkungen auf Enterozyten

Basler, Tina

Mycobacterium (M.) avium paratuberculosis (MAP) is the cause of paratuberculosis (Johne´s Disease), which is a chronic, non treatable enteritis affecting all ruminants characterized by granulomatous inflammation. MAP shows tissue tropism and infection is restricted to the gut for long time. In addition, MAP is presently the most favoured pathogen linked to Crohn´s disease. After oral infection MAP tranlocate from the intestinal lumen into the intestinal tissue via M-cells of the domes of Peyer´s patches. After crossing the epithelial barrier of the intestine MAP is phagocytosed by sub- and intraepithelial macrophages. In this niche, MAP manipulates the host cell in order to survive. The molecular mechanisms which contribute to the persistence of MAP in macrophages and their contribution to disease are still poorly characterized. This study was performed to gain insights into the mechanisms of MAP-specific modulation of infected macrophages and the influence of macrophages on the outcome of inflammation and lesions in the intestine. In the first part of this thesis the molecular mechanisms of macrophage activation or deactivation were analysed to improve the knowledge of an infection with MAP. The immune responsive gene IRG1 was identified by subtraction hybridization as a suitable marker gene, which was highly induced in J774A.1 and RAW264.7 makrophages by LPS (Lipopolysaccharide) but only marginal after an infection with MAP. Furthermore, IRG1 gene was differential expressed in macrophages stimulated with LPS or infected with MAP or the non pathogenic M. smegmatis (MS). Differential gene expression mainly based on a posttranscriptional regulation by mRNA stabilisation. Thus IRG1 RNA stabilisation was detected after stimulation with LPS and infection with MS, but not with MAP. The same RNA stabilisation was detected for TNF-α (Tumor necrosis factorα), which depends on the activity of p38 MAPK (mitogen activated kinase). Accordingly, although stimulated or infected RAW264.7 makrophages indicated a differential activation of p38 MAPK and RNA stabilisation of TNF-α was dependent of p38 MAPK in LPS stimulated macrophages, the RNA stabilisation of IRG1 was independent of p38 MAPK, because the inhibitor of p38 MAPK SB203580 had no effect on IRG1 but on TNF-α RNA stabilisation. The infected macrophage possibly modulates enterocytes in their function like the resorption of nutrients. To improve the understanding of MAP infected macrophages on non infected bystander cells like enterocytes microarray analysis were used to analyse gene expression profiles in macrophages infected with MAP in comparison to the closely related subspecies M. avium (MAA) and combined with interaction studies of infected macrophages with enterocytes in the second part of the thesis. In contrast to MAP, the subspecies MAA shows no tissue tropism and tends to generalize. In addition to the detailed characterization of gene expression a partial protein analysis was performed and both indicated a very similar profile. A direct comparison of MAP and MAA infection revealed only 18 transcripts of proinflammatory mediators with a marginal difference in their expression intensity and a stronger regulation by MAA. In agreement with the transcriptomic results less than ten proteins were found to be differential secreted, leading to the hypothesis of a really similar modulation of MAP compared to MAA infected macrophages. Interestingly, significantly subspecies specific effects were induced in non infected enterocytes by treatment with culture supernatants of infected macrophages. The differential gene expression of IL-10 and TNF-α, as well as TLR5 comparing supernatants of MAP and MAA infected macrophages, indicate the importance of cell to cell interaction of infected macrophages with non infected enterocytes and their importance in establishment of clinical symptoms. Taken together, the results indicate the important role of infected macrophages as host cell for MAP and provides evidence for its involvement in the characteristic chronic inflammation of gut mucosa. It seems that MAP specifically modulate intracellular function of infected macrophages and also effects intercellular mechanisms of defence.

Mycobacterium (M.) avium paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose (Johne´s Disease) bei Wiederkäuern, einer chronischen, nicht therapierbaren Enteritis mit charakteristischen granulomatösen entzündlichen Veränderungen. Die Erkrankung beschränkt sich lange Zeit auf den Darm, was für einen ausgeprägten Darmtropismus von MAP spricht. Darüber hinaus wird eine Beteiligung von MAP im Krankheitsgeschehen des Morbus Crohn diskutiert. Nach oraler Aufnahme gelangt MAP über die M-Zellen des Epithels der Peyerschen Platten in die Darmschleimhaut und wird von sub- und intraepithelialen Makrophagen phagozytiert. Hier vermag der Erreger zu persistieren indem er die Abwehrmechanismen der Wirtszelle zu seinen Gunsten moduliert. Über die molekularen Mechanismen, die MAP zu einer erfolgreichen Persistenz in Makrophagen verhelfen ist bisher wenig bekannt. Aus diesen Fakten ergibt sich die Frage, inwieweit der infizierte Makrophage in seiner Effektorfunktion spezifisch durch MAP beeinflusst wird und welche Rolle er in der Etablierung der entzündlichen Läsionen hat. Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Mechanismen einer Makrophagenaktivierung oder –hemmung nach einer Infektion mit MAP untersucht und mittels subtraktiver Hybridisierung das immune responsive gene IRG1 als ein Markergen identifiziert. IRG1 wurde in J774A.1 und RAW264.7 Makrophagen besonders stark durch LPS (Lipopolysaccharid), ein potenter Stimulator von Makrophagen, aber nur marginal durch MAP, induziert. Der Grund für die differentielle Genexpression von IRG1 nach einer Stimulation mit LPS, einer Infektion mit MAP, oder mit dem nicht pathogenen M. smegmatis (MS) lag im wesentlichen in einer unterschiedlichen posttranskriptionellen Regulation in Form einer differentiellen IRG1 RNA Stabilisierung. Eine Stabilisierung der IRG1 RNA erfolgte nur durch eine Stimulation mit LPS, nicht aber durch MAP. Ein gleicher posttranskriptioneller Mechanismus scheint auch für den proinflammatorischen Mediator TNF-α (Tumornekrosefaktor-alpha) zu gelten, für dessen RNA eine Abhängigkeit von der p38 MAPK (mitogen activated kinase) bekannt ist. Obwohl für die p38 MAPK hier eine differentielle Aktivierung nachgewiesen wurde, und die TNF-α RNA Stabilität in LPS stimulierten Makrophagen p38 MAPK-abhängig war, erwies sich die Stabilität der IRG1 RNA als p38-unabhängig, da die Halbwertszeit der IRG1 RNA im Gegensatz zu TNF-α durch den p38 MAPK-Hemmstoff SB203580 nicht beeinflusst war. Eine Hemmung der Proteinsynthese mit Cycloheximid bewirkte eine Stabilisierung beider RNAs, was dafür spricht, dass ein konstitutiv exprimierter, destabilisierender Proteinfaktor im Stabilisierungsprozess involviert ist. Für ein besseres Verständnis der Mechanismen einer erfolgreichen Infektion mit MAP wurden in dieser Arbeit neben der intrazellulären Modulation des infizierten Makrophagen auch die umfassenden Auswirkungen auf nicht infizierte „bystander“ Zellen untersucht, wie Enterozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels Mikroarray ein Transkriptomprofil von Makrophagen erstellt, die mit MAP infiziert waren. Zum Vergleich erfolgte eine Infektion mit der nahe verwandten Subspezies M. avium (MAA), die im Gegensatz zu MAP keinen ausgeprägten Darmtropismus aufweist und nach erfolgter Infektion ausgehend vom Darm generalisiert. Das ausführlich charakterisierte Transkriptom wurde durch den Nachweis sezernierter Proteine ergänzt und resultierte in nahezu identischen Gen- und Proteinexpressionsprofilen. Lediglich 18 quantitativ differentiell exprimierte Gene waren durch den Vergleich der Infektion von MAP und MAA nachweisbar, wobei MAA im Vergleich zu MAP einige wenige proinflammatorische Mediatoren stärker regulierte. In Übereinstimmung damit resultierte das partielle Sekretomprofil in weniger als zehn quantitativ differentiell sezernierten Proteinen und somit in der Hypothese einer sehr ähnlichen intrazellulären Modulation infizierter Makrophagen durch MAP und MAA. Deutliche subspeziesspezifische Effekte konnten jedoch in der Stimulation nicht infizierter Enterozyten durch Kulturüberstände infizierter Makrophagen dargestellt werden. Durch den differentiellen Genexpressionsnachweis von IL-10, TNF-α sowie TLR5 durch Überstände von Makrophagen nach einer Infektion mit MAP im Vergleich zu MAA konnte die Relevanz der Zell-Zell-Interaktion infizierter Makrophagen mit nicht infizierten Enterozyten und deren Bedeutung in der Etablierung klinischer Symptome gezeigt werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass der Erreger anscheinend spezifisch in die intrazellulären Effektorfunktionen eingreift und darüber hinaus auch die interzellulären Abwehrmechanismen beeinflusst. Dies unterstreicht die besondere Rolle des Makrophagen als Wirtszelle und führt zu der Vermutung einer Beteiligung an den charakteristischen chronisch entzündlichen Veränderungen der Darmschleimhaut.

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Basler, Tina: Mechanismen der Mykobakterien-abhängigen Modulation von Makrophagen und deren Auswirkungen auf Enterozyten. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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