Mechanismen der Mykobakterien-abhängigen Modulation von Makrophagen und deren Auswirkungen auf Enterozyten

Mycobacterium (M.) avium paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose (Johne´s Disease) bei Wiederkäuern, einer chronischen, nicht therapierbaren Enteritis mit charakteristischen granulomatösen entzündlichen Veränderungen. Die Erkrankung beschränkt sich lange Zeit auf den Darm, was für einen ausgeprägten Darmtropismus von MAP spricht. Darüber hinaus wird eine Beteiligung von MAP im Krankheitsgeschehen des Morbus Crohn diskutiert. Nach oraler Aufnahme gelangt MAP über die M-Zellen des Epithels der Peyerschen Platten in die Darmschleimhaut und wird von sub- und intraepithelialen Makrophagen phagozytiert. Hier vermag der Erreger zu persistieren indem er die Abwehrmechanismen der Wirtszelle zu seinen Gunsten moduliert. Über die molekularen Mechanismen, die MAP zu einer erfolgreichen Persistenz in Makrophagen verhelfen ist bisher wenig bekannt. Aus diesen Fakten ergibt sich die Frage, inwieweit der infizierte Makrophage in seiner Effektorfunktion spezifisch durch MAP beeinflusst wird und welche Rolle er in der Etablierung der entzündlichen Läsionen hat. Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Mechanismen einer Makrophagenaktivierung oder –hemmung nach einer Infektion mit MAP untersucht und mittels subtraktiver Hybridisierung das immune responsive gene IRG1 als ein Markergen identifiziert. IRG1 wurde in J774A.1 und RAW264.7 Makrophagen besonders stark durch LPS (Lipopolysaccharid), ein potenter Stimulator von Makrophagen, aber nur marginal durch MAP, induziert. Der Grund für die differentielle Genexpression von IRG1 nach einer Stimulation mit LPS, einer Infektion mit MAP, oder mit dem nicht pathogenen M. smegmatis (MS) lag im wesentlichen in einer unterschiedlichen posttranskriptionellen Regulation in Form einer differentiellen IRG1 RNA Stabilisierung. Eine Stabilisierung der IRG1 RNA erfolgte nur durch eine Stimulation mit LPS, nicht aber durch MAP. Ein gleicher posttranskriptioneller Mechanismus scheint auch für den proinflammatorischen Mediator TNF-α (Tumornekrosefaktor-alpha) zu gelten, für dessen RNA eine Abhängigkeit von der p38 MAPK (mitogen activated kinase) bekannt ist. Obwohl für die p38 MAPK hier eine differentielle Aktivierung nachgewiesen wurde, und die TNF-α RNA Stabilität in LPS stimulierten Makrophagen p38 MAPK-abhängig war, erwies sich die Stabilität der IRG1 RNA als p38-unabhängig, da die Halbwertszeit der IRG1 RNA im Gegensatz zu TNF-α durch den p38 MAPK-Hemmstoff SB203580 nicht beeinflusst war. Eine Hemmung der Proteinsynthese mit Cycloheximid bewirkte eine Stabilisierung beider RNAs, was dafür spricht, dass ein konstitutiv exprimierter, destabilisierender Proteinfaktor im Stabilisierungsprozess involviert ist. Für ein besseres Verständnis der Mechanismen einer erfolgreichen Infektion mit MAP wurden in dieser Arbeit neben der intrazellulären Modulation des infizierten Makrophagen auch die umfassenden Auswirkungen auf nicht infizierte „bystander“ Zellen untersucht, wie Enterozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels Mikroarray ein Transkriptomprofil von Makrophagen erstellt, die mit MAP infiziert waren. Zum Vergleich erfolgte eine Infektion mit der nahe verwandten Subspezies M. avium (MAA), die im Gegensatz zu MAP keinen ausgeprägten Darmtropismus aufweist und nach erfolgter Infektion ausgehend vom Darm generalisiert. Das ausführlich charakterisierte Transkriptom wurde durch den Nachweis sezernierter Proteine ergänzt und resultierte in nahezu identischen Gen- und Proteinexpressionsprofilen. Lediglich 18 quantitativ differentiell exprimierte Gene waren durch den Vergleich der Infektion von MAP und MAA nachweisbar, wobei MAA im Vergleich zu MAP einige wenige proinflammatorische Mediatoren stärker regulierte. In Übereinstimmung damit resultierte das partielle Sekretomprofil in weniger als zehn quantitativ differentiell sezernierten Proteinen und somit in der Hypothese einer sehr ähnlichen intrazellulären Modulation infizierter Makrophagen durch MAP und MAA. Deutliche subspeziesspezifische Effekte konnten jedoch in der Stimulation nicht infizierter Enterozyten durch Kulturüberstände infizierter Makrophagen dargestellt werden. Durch den differentiellen Genexpressionsnachweis von IL-10, TNF-α sowie TLR5 durch Überstände von Makrophagen nach einer Infektion mit MAP im Vergleich zu MAA konnte die Relevanz der Zell-Zell-Interaktion infizierter Makrophagen mit nicht infizierten Enterozyten und deren Bedeutung in der Etablierung klinischer Symptome gezeigt werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass der Erreger anscheinend spezifisch in die intrazellulären Effektorfunktionen eingreift und darüber hinaus auch die interzellulären Abwehrmechanismen beeinflusst. Dies unterstreicht die besondere Rolle des Makrophagen als Wirtszelle und führt zu der Vermutung einer Beteiligung an den charakteristischen chronisch entzündlichen Veränderungen der Darmschleimhaut.