Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss der Spenderzelldifferenzierung auf die Effizienz des somatischen Kerntransfers beim Schwein

Hornen, Nadine

The aim of the present study was to analyse the suitability of a specific stem cell population derived from a primary fibroblast culture, in somatic nuclear transfer (NT). In mice, it had been shown that the use of less differentiated cell types improved the efficiency of NT. Through a modification of the cell culture medium, enrichment of so-called fetal somatic stem cells (FSSCs) could be achieved in a culture of foetal fibroblasts. These cells show no senescence, they cease to express typical fibroblast markers and begin to express charactistic stem cell markers including: OCT4, AP, and STAT3. The enrichment is achieved by the use of a higher serum concentration (30%) with D10 medium either as attached cells in a cell culture dish (in which case 3-dimensional “clumps” form on the confluent culture) or in a suspension culture which permits the formation of 3-dimensional “spheroids”. Because the FSSC, produced in this manner, die when serum is withdrawn, this method of synchronization can not be used and because there is no contact inhibition in this system, it was interesting to perform FACS analysis to determine the percentage of cells at each stage in the cell cycle based on their DNA content. Four NT experiments were performed. In the first experiment, FSSCs from isolated attached colonies were compared with foetal fibroblasts. In the second experiment, the different sizes of FSSCs obtained from dissociation of spheroids were compared with each other. In the third experiment, the blastocyst rate following nuclear transfer using medium sized FSSCs derived from spheroids was compared with that for foetal fibroblasts. The final experiment was to transfer zygotes produced from FSSC nuclear donor cells to foster mothers and evaluate the offspring. The following results were achieved: Cell cycle determination was carried out on FSSCs isolated from 3-dimensional attached colonies and from spheroids. In the FSSCs from attached colonies, 93.7% of the cells were in the G0/G1 stage (2N DNA content) as conpared to the 93.9% of the FSSCs of the spheroids. FSSC nuclear donors from attached colonies gave a significantly lower blastocyst rate than foetal fibroblast donor cells. However, the number of cells in the resultant blastocysts showed no significant differences between groups. The comparison of spheroid derived FSSC donor cells of different sizes showed no significant differences in blastocyst rate and cell number of blastocysts. The three groups were cells with diameters of  14µm (“small”); 15-20µm (“medium”); and 23-28µm (“large”). The use of medium sized FSSCs from spheroids in comparison to foetal fibroblasts as nuclear donor cells, showed no significant differences in blastocyst rate or in the cell number of the resultant blastocysts. Interestingly, these results differed from those obtained with attached FSSCs (see 2 above). Visualisation of ICM and TE cells by differential staining showed no significant differences between blastocysts obtained from FSSCs or foetal fibroblasts donor cells. The proportion of ICM cells compared to total cell number was 41.7%  ± 14.4 with FSSCs and 42.3% ± 17.3 with foetal fibroblasts. In both cases, the proportion of ICM cells was higher than that reported in previous studies. Medium sized (15-20µm) FSSCs were used as donor cells and the reconstructed embryos were transferred to foster mothers. Pregnancy was established in 3 of 7 transfers, which is within the normal range observed in our laboratory when fibroblasts are used as donor cells. All pregnant sows came to birth. Seven piglets were born totally, 3 of them were vital and show normal development. These results show that FSSCs are able to generate cloned embryos, that pregnancies can be established and vital piglets can be generated. Interestingly, the efficiency of nuclear transfer with the FSSCs was the same, but not better than, that obtained with foetal fibroblasts. The hypothesis that the stem cells would be more easily reprogrammed was not supported by these results. A possible explanation could be that the FSSCs in these cultures are not a homogeneous population of cells. In addition, while the population of FSSCs is enriched by the special culture conditions, some residual foetal fibroblasts are expected in this system. For these reasons, some additional method for donor cell selection would be beneficial. It was found that selection of donor cells based on simply on size was not useful. Further investigations based on other criteria for selection from the FSSC population may enhance the efficiency of the nuclear transfer.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Brauchbarkeit einer spezifischen Stammzellpopulation, die zuvor aus primären Fibroblastenkulturen isoliert worden ist, für den somatischen Kerntransfer zu prüfen. Studien bei der Maus ergaben, dass der Einsatz von Zellen mit Stammzelleigenschaften die Effizienz verbessert werden kann. Durch eine Modifikation des Zellkulturmediums war eine Anreicherung so genannter fetaler somatischer Stammzellen (FSSCs) in fetalen Fibroblasten Kulturen möglich. Diese Zellen zeigen unter Umständen keine Seneszenz, verlieren typische Fibroblastenmarker und exprimieren Stammzellmarker wie OCT4, AP oder STAT3. Die Anreicherung erfolgt durch ein Zellkulturmedium mit erhöhtem Serumanteil (30%) in einer Monolayerkultur in Form von 3D-Kolonien oder in einer Suspensionskultur in Form von Sphäroiden. Da die Zellkulturen, in denen FSSCs angereichert wurden, nicht serumreduziert wurden und eine Kontaktinhibition in dieser Kultur nicht stattfindet, wurde zunächst eine Zellzyklusbestimmung der FSSCs durchgeführt. Zum Vergleich der beiden Spenderzellpopulationen wurden im ersten Teil in vitro-Versuche durchgeführt. Im ersten Versuch wurden FSSCs aus isolierten Kolonien mit fetalen Fibroblasten verglichen. Im zweiten Versuch wurden FSSCs unterschiedlicher Größe aus Sphäroiden miteinander verglichen und im dritten schließlich FSSCs ‚mittlerer’ Größe aus Sphäroiden mit fetalen Fibroblasten. Um das in-vivo-Potential der FSSCs zu überprüfen, wurden im Anschluss an die in-vitro-Versuche Embryotransfers mit Kerntransferembryonen durchgeführt. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Die Zellzyklusbestimmung wurde bei FSSCs aus isolierten 3D-Kolonien und aus Sphäroiden durchgeführt. Bei den FSSCs aus isolierten 3D-Kolonien befanden sich 93,7% der Zellen in der G0/G1-Phase und bei den FSSCs aus den Sphäroiden 93,9%. Der Einsatz von FSSCs aus isolierten Kolonien ergab eine signifikant schlechtere Blastozystenrate im Vergleich zu fetalen Fibroblasten als Spenderzellen. Die Zellzahlen der erstellten Blastozysten wiesen keine signifikanten Unterschiede auf. Der Vergleich unterschiedlich großer FSSCs aus Sphäroiden als Spenderzellen ergab keine signifikanten Unterschiede in der Blastozystenrate und der Zellzahl der Blastozysten. Die Zellen, die selektiert wurden, hatten einen Durchmesser von ~14µm (‚kleine’), 15-20µm (‚mittlere’) und 23-28µm (‚große’). Der Einsatz von FSSCs ‚mittlerer’ Größe aus Sphäroiden im Vergleich zu fetalen Fibroblasten ergab keine signifikanten Unterschiede in der Blastozystenrate und der Zellzahl der Blastozysten. Durch den Einsatz von diesen FSSCs konnten demnach gleiche Effizienzen erreicht werden, wie mit fetalen Fibroblasten. Die Darstellung von ICM- und TE-Zellen in geklonten Blastozysetn durch eine Differentialfärbung ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen FSSCs und fetalen Fibroblasten als Spenderzellen. Der Anteil an ICM-Zellen an der Gesamtzellzahl war bei beiden Gruppen mit 41,7 ± 14,3 (FSSCs) bzw. 42,3 ± 17,3 (fetale Fibroblasten) im Vergleich zu anderen Arbeiten deutlich höher. In Embryotransferversuchen wurden FSSCs ‚mittlerer’ Größe aus Sphäroiden als Spenderzellen verwendet und die erstellten Kerntransferembryonen auf Empfängertiere übertragen. Bei 3 von 7 Empfängertieren konnte eine Trächtigkeit etabliert werden. Alle drei Empfängertiere kamen zur Geburt. Insgesamt wurden 7 Ferkel geboren, von denen 3 vital sind und bis heute eine normale Entwicklung aufweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass FSSCs dazu in der Lage sind, geklonte Embryonen hervorzubringen. In in-vivo-Versuchen können zudem Trächtigkeiten etabliert und vitale Ferkel hervorgebracht werden. Ebenso wie in den in-vitro-Versuchen entsprechen die Ergebnisse, die mit den FSSCs erzielt wurden, den Effizienzen, die bisher auch mit fetalen Fibroblasten erzielt werden konnten. Obwohl FSSCs Stammzelleigenschaften aufweisen und damit vermutlich leichter zurückprogrammiert werden können, konnte die Effizienz noch nicht gesteigert werden. Eine mögliche Ursache dafür könnte eine nicht ausreichende Selektion der Zellen sein. Obwohl die FSSCs durch spezielle Kulturbedingungen angereichert werden können, befinden sich in jeder Kultur auch Zellen ohne Stammzelleigenschaften. Besonders der Versuch zum Vergleich der unterschiedlichen Zellgrößen zeigt, dass eine Selektion anhand morphologischer Gesichtpunkte nicht möglich ist. Weitere Untersuchungen, insbesondere zur besseren Selektion der FSSCs können zu einer Effizienzsteigerung des Kerntransfers mit FSSCs als Spenderzellen beitragen.

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Hornen, Nadine: Einfluss der Spenderzelldifferenzierung auf die Effizienz des somatischen Kerntransfers beim Schwein. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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