Überprüfung der intestinalen Permeabilität bei gesunden Hunden unter Verwendung von Iohexol

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines einfachen, in der täglichen klinischen Arbeit einsetzbaren Iohexol Permeabilitäts-Serum Tests (IPST) unter Bestimmung der geeigneten Iohexol- Dosierung sowie des Referenzwertes beim gesunden Hund. Vorangestellt wurde die Entwicklung einer Festphasenextraktion (SPE) zur Iohexol-Analyse in den Matrizes Serum und Urin. Diese Methode wurde mittlerweile in Helsinki eingerichtet.   Verschiedene Konditionierungs-, Wasch- und Elutionslösungen sowie verschiedene Volumina wurden bei der Erarbeitung der SPE getestet. Die Überprüfung unterschiedlicher SPE- Kartuschen rundete die Ausarbeitung der SPE ab. Anhand verschiedener HPLC-Säulen, unterschiedlicher Konzentrationen der Bestandteile der flüssigen Phase sowie Veränderungen in der Länge des Gradienten-programmes sollte die Trennung der Iohexol- Isomere erarbeitet werden. Der Einsatz eines Internen Standards diente der Sicherung der Analyse. Die Ermittlung von Wiederfindungsraten veranschaulichte Präzision und Reproduzierbarkeit der entwickelten Analyse. Die in die Studie eingesetzten Hunde wurden anschließend einer Gesundheitsüberprüfung unterzogen. Parameter der Hämatologie, der Leber sowie Blutzucker, Cholesterin und Gesamteiweiß bildeten neben der Bestimmung von Parametern der Bauchspeicheldrüse sowie Folsäure und Kobalamin das Fundament. Eine Gastroduodenoskopie mit Biopsieentnahme stellte die Voraussetzung für eine makroskopische, histologische und mikrobiologische Untersuchung der Darmschleimhaut dar. Zwei gesunden Hunden wurden die Dosierungen 0,25/ 0,5/ 1,0/ 2,0 oder 4,0 ml Omnipaque®-350/kg KGW oral appliziert. Blutentnahmen erfolgten nach 0,5 Stunden und des Weiteren alle 60 min über einen Zeitraum von sechs Stunden. Zu jedem Zeitpunkt schloss sich die Aufnahme eines abdominalen Röntgenbildes im dorso- ventralen Strahlengang an. Dass die Ergebnisse beider Hunde vergleichbar waren, stellte der „unverbundene Wilcoxon-Test“ sicher. Die geeignete Dosierung wurde zwecks Ermittlung eines IPST-Referenzwertes zweimal an acht gesunden Hunden angewendet. Aus den gewonnenen Iohexolwerten folgte für jede Stunde die Berechung des Mittelwertes sowie der Standartabweichung und des Minimums und Maximums.   Die entwickelte SPE bestand für Serumproben in der Konditionierung von LiChrolut® EN Kartuschen mit jeweils 4 ml Methanol und physiologischer Kochsalzlösung. Nach Probenaufgabe und Zugabe der Natriumdiatrizoat-Dihydrat (Diatrizoat)- Kontroll-substanz wurden die meisten störenden Proteine mit 6 ml physiologischer Kochsalzlösung von der Kartusche herunter gewaschen. Im Folgenden eluierte die Probe nach 14 ml Methanol/ verdünnter Phosphorsäure bei verschiedenen Temperaturen. Nach Zugabe von 500 µl Aqua tridest folgte die Einengung des Eluats auf 1 ml mittels eines Dünnschichtverdampfers. Letztendlich wurde die Probe durch einen Polytetrafluorethylenfilter gegeben, gewogen und bei -18 Grad bis zur HPLC-Analyse aufbewahrt. Bei Urinproben fand anstelle von physiologischer Kochsalzlösung der di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat- Puffer pH 9 Verwendung. Nach Einengung erfolgte die Verdünnung der Probe auf 3 ml Aqua tridest. Für die HPLC-Analyse wurde eine Gradientenpumpe, ein UV- Detektor (λ= 246 nm), eine C18- Vorsäule Eurospher 100 und eine C30-HPLC-Säule Prontosil 200 verwendet. Die flüssige Phase beinhaltete Aqua tridest: Methanol im Verhältnis 92:8 (v/v), 15 mM di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat und 1,5 mM Tetrabutyl-ammoniumchlorid, eingestellt auf den pH 7,5. Um ein Gradientenprogramm einzusetzen, bestand die zweite flüssige Phase in Aqua tridest: Methanol im Verhältnis 60:40 (v/v) mit den gleichen Pufferkonzentrationen. Präzision und Reproduzierbarkeit veranschaulichten Wiederfindungsraten, welche nach Dotierungen mit 15 µg Iohexol/ml Serum 73,6 ± 10,7 % (MW ± SD) betrugen, nach Dotierungen mit 20-25 µg/ml 82,6 ± 8 % und nach 50-75 µg/ml 82,6 ± 3,9 %. Wiederfindungsraten der Kontrollsubstanz Diatrizoat befanden sich in dem Bereich 48 ± 7,2 % nach Dotierungsversuchen. Als interner Standard konnte Diatrizoat dadurch nicht verwendet werden, jedoch als Kontrollsubstanz.   Die Hunde zeigten in der Gesundheitsüberprüfung keinerlei Auffälligkeiten in den hämatologischen oder biochemischen Parametern. Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse traten nicht auf. Die Vitamin B12-Werte der Hunde Nr. 1 und 6 lagen unterhalb des Referenzwertes (258 respektive 247 pg/ml). Die Folsäure- Spiegel aller Hunde waren zum Kontrollzeitpunkt normal. Bei der Gastroduodenoskopie fiel lediglich eine geringgradig höckrige Schleimhaut bei Hund Nr. 4 auf. Die histologischen und mikrobiologischen Untersuchungen zeigten keine Abweichungen von der Norm. Der Wilcoxon- Test stellte sicher, dass die Ergebnisse beider Hunde vergleichbar sind. Die gemessenen Iohexol- Konzentrationen nach oraler Gabe der 2,0 ml Omnipaque®-350/kg KGW Dosierung befanden sich mehrheitlich im Bereich von 13-20 µg/kg und wurden damit als am besten geeignete für den IPST ausgewählt. Die Röntgenaufnahmen bestätigten, dass mit dieser Dosierung eine Kontrastmittelpassage ohne Schwierigkeiten durchführbar ist. Die zweimal bei acht Hunden im Serum detektierten Iohexol- Werte wurden zu einer Verlaufskurve zusammengefasst. Diese gibt Hinweise auf einen Referenzwertbereich für den IPST. Eine Stunde nach Administration der 2,0 ml Omnipaque®-350- Lösung wurden im Mittel 8,89 ± 2,31 µg Iohexol/ml Serum (MW ± SD) detektiert. Zur zweiten Stunde erhöhte sich der Wert auf 12,48 ± 3,13 µg/ml, um danach langsam abzufallen.