Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Überprüfung der intestinalen Permeabilität bei gesunden Hunden unter Verwendung von Iohexol

Klenner, Stefanie

The aim of the present study was the development of a simple, easy to use iohexol permeability-serum test (IPST). The adequate iohexol-dosage and reference value in healthy dogs were established. The development of a solid phase extraction (SPE) for analysis of iohexol in serum and urine preceded the actual study.   Different solutions and volumes for the SPE conditioning-, washing- and elution- steps were tested in conjunction with the assessment of miscellaneous SPE cartridges. The iohexol-isomers should be separated by using diverse HPLC- columns, variable concentrations of the fluid phase and modifications of the gradient program length. A control substance should verify the analysis. Recovery rates ascertained precision and reproducibility. Dogs that were part of the study underwent a thorough health check which consisted in measuring haematology and liver parameters as well as blood glucose, cholesterol and total protein. Pancreatic parameters, folic acid and cobalamin values completed the health check. A gastroduodenoscopy and biopsy specimens were performed for macroscopic, histologic and microbiologic examinations of the intestinal mucosa. Two clinically healthy dogs were included in the dose finding study. Iohexol was given orally via gastric tube as Omnipaque®-350 to the starved dog. Five different dosages were used to find the adequate one. On a weekly base the first dog received four different dosages, and the second three different dosages. The dosages were 0.25/ 0.5/ 1.0/ 2.0 and 4.0 ml Omnipaque®-350/kg body weight. Dosages 1.0 and 2.0 ml/kg were given to both dogs. Dorso- ventral abdominal radiographs and blood samples were taken. The Wilcoxon-test ascertained the comparability of the results of the two dogs. The appropriate dosage was applied to eight healthy dogs to develop a reference value. For all measured Iohexol- values mean, standard deviation, minimum and maximum was calculated.   For SPE LiChrolut®EN cartridges were conditioned with 4 ml methanol and 4 ml physiologic sodium chloride solution. The serum sample and the control substance sodium diatrizoate dehydrate were added. Most of the interfering proteins were washed off the cartridge with an additional 6 ml physiologic sodium chloride solution. Finally, the adsorbed iohexol was eluted with 14 ml methanol / diluted phosphoric acid at different temperatures. After administration of 500 µl aqua tridest, the eluate was concentrated to a final volume of 1 ml using a thin-film evaporator. Ultimately the solution was filtered through a polytetrafluorethylene - filter, weighed and stored at –18 °C until HPLC analysis. The physiologic sodium solution was exchanged with di-potassiumhydrogenphosphate-trihydrate buffer pH 9 for urine samples. After evaporation the sample was diluted with 3 ml aqua tridest. For HPLC analysis, gradient pump, UV-wavelength detector (246 nm), Prontosil 200 C30 column, and Eurospher 100 precolumn were used. The mobile phase consisted of aqua tridest: methanol 92:8 (v/v), 15 mM di-potassiumhydrogenphosphate-trihydrate, and 1.5 mM tetrabutylammoniumchloride. For running a gradient program the second mobile phase consisted of aqua tridest: methanol 60:40 (v/v) with the same buffer concentrations. Recovery rates showed precision and reproducibility of the developed method. After spiking serum samples with 15 µg Iohexol/ml recovery rates represented 73.6 ± 10.7 % (Mean ± SD), after spiking with 20-25 µg/ml 82.6 ± 8 % and after 50-75 µg/ml 82.6 ± 3.9 %. The control substance Diatrizoate constituted recovery rates of 48 ± 7.2 %. Diatrizoate could not serve as an internal standard because of these low values. During the dog’s health check no abnormalities were found in the haematological and biochemical parameters. Diseases of the pancreas were not apparent either. In dogs No.1 and 6 Vitamin B12 values laid below the reference range (258 and 247 pg/ml respectively). The folic acid levels were not suspicious. Solely in gastro-duodenoscopy of dog No. 4 a minor unevenness of the mucosa was noticed. Neither histological nor microbiological examination showed any abnormalities. The Wilcoxon-test confirmed that the results of both dogs incorporated in the dose finding study were comparable. After oral application of 2.0 ml Omnipaque®-350/kg body weight the measured Iohexol concentrations tended to lay in the range of 82.6 % recovery rates. Therefore this dosage was chosen as adequate for the IPST. With this dosage a contrast media passage is easily feasible confirmed by the radiographs. The Iohexol- values detected in serum of eight healthy dogs gave evidences of an IPST reference range. One hour after administration of the 2.0 ml Omnipaque®-350 solution 8.89 ± 2.31 µg Iohexol/ ml serum (mean ± SD) were detected, rising to 12.48 ± 3.13 µg/ml at two hours and declining afterwards.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines einfachen, in der täglichen klinischen Arbeit einsetzbaren Iohexol Permeabilitäts-Serum Tests (IPST) unter Bestimmung der geeigneten Iohexol- Dosierung sowie des Referenzwertes beim gesunden Hund. Vorangestellt wurde die Entwicklung einer Festphasenextraktion (SPE) zur Iohexol-Analyse in den Matrizes Serum und Urin. Diese Methode wurde mittlerweile in Helsinki eingerichtet.   Verschiedene Konditionierungs-, Wasch- und Elutionslösungen sowie verschiedene Volumina wurden bei der Erarbeitung der SPE getestet. Die Überprüfung unterschiedlicher SPE- Kartuschen rundete die Ausarbeitung der SPE ab. Anhand verschiedener HPLC-Säulen, unterschiedlicher Konzentrationen der Bestandteile der flüssigen Phase sowie Veränderungen in der Länge des Gradienten-programmes sollte die Trennung der Iohexol- Isomere erarbeitet werden. Der Einsatz eines Internen Standards diente der Sicherung der Analyse. Die Ermittlung von Wiederfindungsraten veranschaulichte Präzision und Reproduzierbarkeit der entwickelten Analyse. Die in die Studie eingesetzten Hunde wurden anschließend einer Gesundheitsüberprüfung unterzogen. Parameter der Hämatologie, der Leber sowie Blutzucker, Cholesterin und Gesamteiweiß bildeten neben der Bestimmung von Parametern der Bauchspeicheldrüse sowie Folsäure und Kobalamin das Fundament. Eine Gastroduodenoskopie mit Biopsieentnahme stellte die Voraussetzung für eine makroskopische, histologische und mikrobiologische Untersuchung der Darmschleimhaut dar. Zwei gesunden Hunden wurden die Dosierungen 0,25/ 0,5/ 1,0/ 2,0 oder 4,0 ml Omnipaque®-350/kg KGW oral appliziert. Blutentnahmen erfolgten nach 0,5 Stunden und des Weiteren alle 60 min über einen Zeitraum von sechs Stunden. Zu jedem Zeitpunkt schloss sich die Aufnahme eines abdominalen Röntgenbildes im dorso- ventralen Strahlengang an. Dass die Ergebnisse beider Hunde vergleichbar waren, stellte der „unverbundene Wilcoxon-Test“ sicher. Die geeignete Dosierung wurde zwecks Ermittlung eines IPST-Referenzwertes zweimal an acht gesunden Hunden angewendet. Aus den gewonnenen Iohexolwerten folgte für jede Stunde die Berechung des Mittelwertes sowie der Standartabweichung und des Minimums und Maximums.   Die entwickelte SPE bestand für Serumproben in der Konditionierung von LiChrolut® EN Kartuschen mit jeweils 4 ml Methanol und physiologischer Kochsalzlösung. Nach Probenaufgabe und Zugabe der Natriumdiatrizoat-Dihydrat (Diatrizoat)- Kontroll-substanz wurden die meisten störenden Proteine mit 6 ml physiologischer Kochsalzlösung von der Kartusche herunter gewaschen. Im Folgenden eluierte die Probe nach 14 ml Methanol/ verdünnter Phosphorsäure bei verschiedenen Temperaturen. Nach Zugabe von 500 µl Aqua tridest folgte die Einengung des Eluats auf 1 ml mittels eines Dünnschichtverdampfers. Letztendlich wurde die Probe durch einen Polytetrafluorethylenfilter gegeben, gewogen und bei -18 Grad bis zur HPLC-Analyse aufbewahrt. Bei Urinproben fand anstelle von physiologischer Kochsalzlösung der di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat- Puffer pH 9 Verwendung. Nach Einengung erfolgte die Verdünnung der Probe auf 3 ml Aqua tridest. Für die HPLC-Analyse wurde eine Gradientenpumpe, ein UV- Detektor (λ= 246 nm), eine C18- Vorsäule Eurospher 100 und eine C30-HPLC-Säule Prontosil 200 verwendet. Die flüssige Phase beinhaltete Aqua tridest: Methanol im Verhältnis 92:8 (v/v), 15 mM di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat und 1,5 mM Tetrabutyl-ammoniumchlorid, eingestellt auf den pH 7,5. Um ein Gradientenprogramm einzusetzen, bestand die zweite flüssige Phase in Aqua tridest: Methanol im Verhältnis 60:40 (v/v) mit den gleichen Pufferkonzentrationen. Präzision und Reproduzierbarkeit veranschaulichten Wiederfindungsraten, welche nach Dotierungen mit 15 µg Iohexol/ml Serum 73,6 ± 10,7 % (MW ± SD) betrugen, nach Dotierungen mit 20-25 µg/ml 82,6 ± 8 % und nach 50-75 µg/ml 82,6 ± 3,9 %. Wiederfindungsraten der Kontrollsubstanz Diatrizoat befanden sich in dem Bereich 48 ± 7,2 % nach Dotierungsversuchen. Als interner Standard konnte Diatrizoat dadurch nicht verwendet werden, jedoch als Kontrollsubstanz.   Die Hunde zeigten in der Gesundheitsüberprüfung keinerlei Auffälligkeiten in den hämatologischen oder biochemischen Parametern. Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse traten nicht auf. Die Vitamin B12-Werte der Hunde Nr. 1 und 6 lagen unterhalb des Referenzwertes (258 respektive 247 pg/ml). Die Folsäure- Spiegel aller Hunde waren zum Kontrollzeitpunkt normal. Bei der Gastroduodenoskopie fiel lediglich eine geringgradig höckrige Schleimhaut bei Hund Nr. 4 auf. Die histologischen und mikrobiologischen Untersuchungen zeigten keine Abweichungen von der Norm. Der Wilcoxon- Test stellte sicher, dass die Ergebnisse beider Hunde vergleichbar sind. Die gemessenen Iohexol- Konzentrationen nach oraler Gabe der 2,0 ml Omnipaque®-350/kg KGW Dosierung befanden sich mehrheitlich im Bereich von 13-20 µg/kg und wurden damit als am besten geeignete für den IPST ausgewählt. Die Röntgenaufnahmen bestätigten, dass mit dieser Dosierung eine Kontrastmittelpassage ohne Schwierigkeiten durchführbar ist. Die zweimal bei acht Hunden im Serum detektierten Iohexol- Werte wurden zu einer Verlaufskurve zusammengefasst. Diese gibt Hinweise auf einen Referenzwertbereich für den IPST. Eine Stunde nach Administration der 2,0 ml Omnipaque®-350- Lösung wurden im Mittel 8,89 ± 2,31 µg Iohexol/ml Serum (MW ± SD) detektiert. Zur zweiten Stunde erhöhte sich der Wert auf 12,48 ± 3,13 µg/ml, um danach langsam abzufallen.

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Klenner, Stefanie: Überprüfung der intestinalen Permeabilität bei gesunden Hunden unter Verwendung von Iohexol. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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