Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen über die Rolle von Matrix-Metalloproteinasen und deren Inhibitoren bei der demyelinisierenden murinen Theilervirus-Enzephalomyelitits mittels RT-qPCR

Ulrich, Reiner Georg

In the literature section a short review of the present knowledge of the virology, epidemiology, disease signs, pathology and pathogenesis of chronic demyelinating Theiler`s murine encephalomyelitis (TME) is given. The investigations concerning the constitutive expression of matrix-metalloproteinases (MMPs) and their endogenous inhibitors ("tissue inhibitors of matrix-metalloproteinases", TIMPs) in the spinal cord are based on the results obtained from 12 adult, female SJL/JHanHsd control mice. For the investigations upon the role of MMPs and TIMPs in demyelinating TME, 76 female SJL/JHanHsd mice, infected with the BeAn-strain of TMEV at the age of five weeks and 77 placebo (sham)-infected female SJL/JHanHsd mice were killed in groups of six, 0, 1, 4, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 98, 147, and 196 days post infection (d.p.i.). For the description of the course of chronic demyelinating TME a clinical evaluation was performed. A 60-second-hangtest, a rotarod assay and an evaluation of stride length were performed as special tests for the evaluation of motor coordination and strength. For the histological examination hematoxylin-eosin and luxol-fast-blue-cresylechtviolet stained sections of formalin-fixed, paraffin-embedded spinal cord were examinated. The latter consisted of a semiquantitative scoring of the degree of meningitis, poliomyelitis, leukomyelitis, hypercellularity of the gray and white matter, demyelination and malacia in defined cervical, thoracal and lumbal segments of the spinal cord For the quantification of the mRNA expression of the MMPs (-2, -3, -7, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -24), TIMPs (-1, -2, -3, -4), the four housekeeping genes (GAPDH, ß-actin, HPRT, SDHA) and the TMEV-RNA in the spinal cords, RT-qPCR using the Brilliant® SYBR® Green QPCR Core Reagent Kit (Stratagene®) was performed employing the MX4000TM Multiplex Quantitative PCR System (Stratagene®) with an absolute external cDNA standard. No clinical signs were observed during the early infection phase from 0 to 21 d.p.i. except for a weight loss starting 7 d.p.i. During the late infection phase from 21 to 196 d.p.i., a progressive ataxia was detectable beginning 56 d.p.i. The rotarod assay was able to detect a loss of motor control and strength already 28 d.p.i., the 60-seconds-hangtest 42 d.p.i. and the stride length measurement 98 d.p.i. The histological examination of the spinal cords revealed mild, focal, lymphohistiocytic meningomyelitis during the early infection phase. In the late infection phase, a moderate to severe, focal to coalescing, lymphohistiocytic meningoleukomyelitis was accompanied by a significant demyelination from 28 d.p.i. on. In 94,4% of all spinal cords of TMEV-infected mice TMEV-RNA was detectable until 196 d.p.i., whereas none of the placebo-infected mice showed a positive RT-qPCR result. In the spinal cords of adult control mice, a high constitutive mRNA expression of TIMP-2, -3, -4, followed by MMP-14, -15, and -24 was detected. Additionally, a moderate constitutive expression of MMP-2, -9 and -11 followed by a basal expression of MMP-3, -7, -12, -13, and TIMP-1 was shown. Significant, moderate to severe, timepoint-dependent changes of the relative gene expression were shown in the spinal cords of the TMEV-infected mice for MMP-2, -3, -11, -12, -13, -14, and TIMP-1. MMP-12 showed a moderate to severe relative up-regulation in TMEV-infected mice during the chronic infection phase from 28 to 196 d.p.i. MMP-12 was the gene with the strongest correlation between mRNA-expression and demyelination and malacia. MMP-3 showed a relative up-regulation of the mRNA expression in TMEV-infected mice during the acute infection phase at 1 d.p.i. as well as a moderate to high relative up-regulation during the chronic infection phase from 28 to 196 d.p.i. TIMP-1 showed a moderate to high relative up-regulation of the mRNA expression in TMEV-infected mice from 1 to 196 d.p.i. TIMP-1 was the gene with the strongest correlation of the mRNA expression towards the TMEV-RNS-load. Further changes of mRNA expression, though less prominent were observed for MMP-2, -11, -13, and -14. In summary, during the early infection phase of chronic demyelinating TME, a robust up-regulation of the mRNA expression of MMP-3 and TIMP-1 was observed. These up-regulations were most likely due to a direct effect of the TMEV infection on neurons. The increased MMP-3 mRNA expression could represent an initial signal triggering a cascade of proteolytic enzymes, that might lead to an opening of the blood-brain-barrier and initial demyelination. The increased TIMP-1 mRNA expression is possibly associated with neuroprotective activities. During the late phase of infection, a strong increase in MMP-12 mRNA expression was noticed. This up-regulation might be associated with the massive infiltration of macrophages to the demyelinating lesions. Furthermore, MMP-12, which seems to be responsible for the extravasation and migration of macrophages as well as the phagocytosis of cellular debris, could also contribute to secondary myelin destruction due to bystander demyelination.

In der Literaturübersicht wird eine kurze Zusammenfassung des derzeitigen Wissensstandes bezüglich der Virologie, Epidemiologie, Klinik, Pathologie sowie Pathogenese der chronischen demyelinisierenden murinen Theilervirus-Enzephalomyelitis ("Theiler`s murine encephalomyelitis", TME) gegeben. Für die Untersuchungen zur konstitutiven Expression der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sowie ihrer Inhibitoren ("tissue inhibitors of matrix-metalloproteinases", TIMPs) im Rückenmark wurden 12 adulte, weibliche SJL/JHanHsd Mäuse verwendet. Die Untersuchungen zur Rolle der MMPs und TIMPs im Verlauf der chronischen demyelinisierenden TME basieren auf der Auswertung von 76 im Alter von 5 Wochen mit dem BeAn-Stamm des Theilervirus ("Theiler’s murine encephalomyelitis virus", TMEV) infizierten weiblichen SJL/JHanHsd-Mäusen sowie von 77 Plazebo-infizierten weiblichen SJL/JHanHsd-Mäusen, die jeweils in Sechsergruppen an den Versuchstagen 0, 1, 4, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 98, 147 und 196 post infektionem (p.i.) getötet wurden. Zur Beschreibung der chronischen demyelinisierenden TME wurden eine klinische Bewertung, sowie als spezielle Tests für Motorkoordination und –stärke ein 60-Sekunden-Hängtest, eine Rotarodmessung und eine Schrittlängenmessung durchgeführt. Die histologische Untersuchung wurde an Hämatoxylin-Eosin und Luxol-Fast-Blue-Kresylechtviolett gefärbten Transversalschnitten des Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Rückenmarks durchgeführt. Hierbei erfolgte eine semiquantitative Bewertung des Grades an Meningitis, Poliomyelitis, Leukomyelitis, Hyperzellularität der grauen sowie der weißen Substanz, Demyelinisierung und Malazie in definierten zervikalen, thorakalen und lumbalen Rückenmarksabschnitten. Zur Quantifizierung der mRNS-Expression der MMPs (-2, -3, -7, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -24), TIMPs (-1, -2, -3, -4), der vier "Housekeeping"-Gene (GAPDH, ß-Aktin, HPRT, SDHA) sowie der TMEV-RNS im Rückenmark wurde eine RT-qPCR mit dem Brilliant® SYBR® Green QPCR Core Reagent Kit (Stratagene®) auf einem MX4000TM Multiplex Quantitative PCR System (Stratagene®) unter Verwendung von absoluten externen cDNS-Standards durchgeführt. Klinisch zeigten die TMEV-infizierten Mäuse in der frühen Infektionsphase vom Versuchstag 0 bis 21 außer einer relativen Gewichtsabnahme ab Versuchstag 7 keine Symptomatik. In der späten Infektionsphase vom Versuchstag 21 bis 196 konnte ab dem 56. Versuchstag eine chronische, progressive Ataxie beobachtet werden. Mittels Rotarodmessung war es bereits ab dem 28. Versuchstag möglich, bei den TMEV-infizierten Mäusen eine reduzierte Motorkoordination bzw. –kraft nachzuweisen, mittels 60-Sekunden-Hängtest ab dem 42. Versuchstag und mittels Schrittlängenmessung erst ab dem 98. Versuchstag. Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung der TMEV-infizierten Mäuse wurde in der frühen Infektionsphase eine geringgradige, herdförmige lymphohistiozytäre Meningomyelitis ermittelt. In der späten Infektionsphase kam es in Verbindung mit einer mittel- bis hochgradigen, herdförmig-konfluierenden, lymphohistiozytären Meningo- und Leukomyelitis ab dem 28. Versuchstag zu einer signifikanten Demyelinisierung. In 94,4% aller Rückenmarksproben der TMEV-infizierten Mäuse war bis zum 196. Versuchstag Virus-RNS nachweisbar, wohingegen bei keiner der Plazebomäuse ein positives RT-qPCR Ergebnis ermittelt wurde. Im Rückenmark von gesunden, adulten Kontrollmäusen konnte eine hohe konstitutive mRNS-Expression von TIMP-2, -3 und -4 gefolgt von MMP-14, -15 und -24 nachgewiesen werden. Des Weiteren fand sich eine mittlere konstitutive mRNS-Expression von MMP-2, -9 und -11 gefolgt von einer geringen mRNS-Expression von MMP-3, -7, -12, -13 und TIMP-1. Bei der chronischen demyelinisierenden TME konnten signifikante, mittel- bis höchstgradige zeitpunktabhängige Veränderungen der relativen mRNS-Expression im Rückenmark der TMEV-infizierten Mäuse für MMP-2, -3, -11, -12, -13, -14 und TIMP-1 bestimmt werden. MMP-12 zeigte eine mittel- bis höchstgradige relative Aufregulierung bei den TMEV-infizierten Mäusen in der späten Infektionsphase vom 28. bis 196. Versuchstag. MMP-12 war das Gen mit der höchsten Korrelation der mRNS-Expression zu Demyelinisierung und Malazie. MMP-3 zeigte sowohl eine hochgradige relative Aufregulierung der mRNS-Expression bei den TMEV-infizierten Tieren in der frühen Infektionsphase am Versuchstag 1 sowie eine mittel- bis hochgradige relative Aufregulierung in der späten Infektionsphase vom 28. bis 196. Versuchstag. TIMP-1 zeigte vom 1. bis 196. Versuchstag eine mittel- bis hochgradige relative Aufregulierung der mRNS-Expression bei den TMEV-infizierten Mäusen. TIMP-1 war das Gen mit der höchsten Korrelation der mRNS-Expression zur TMEV-RNS-Menge. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es in der frühen Infektionsphase der chronischen demyelinisierenden TME zu einer hochgradigen Aufregulierung der mRNS-Expression von MMP-3 und TIMP-1 kommt, die vermutlich direkt durch die Infektion von Neuronen mit dem TMEV ausgelöst wird. Die aufregulierte MMP-3 mRNS-Expression könnte hierbei das initiale Signal zur Aktivierung einer Kaskade proteolytischer Enzyme sein, welche möglicherweise eine Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und eine initiale Demyelinisierung auslöst. Die Aufregulierung der TIMP-1 mRNS-Expression wird mit einer neuroprotektiven Wirkung in Verbindung gebracht. In der späten Infektionsphase dominierte die starke Aufregulierung der MMP-12 mRNS-Expression. Sie ist vermutlich auf die massive Infiltration der demyelinisierenden Läsionen mit Makrophagen zurückzuführen. MMP-12, welches essentiell für die Migration von Makrophagen im Gewebe sowie die Phagozytose von Zelltrümmern zu sein scheint, könnte bedeutend zur Entstehung der Demyelinisierung im Rahmen einer "bystander demyelination" beitragen.

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Ulrich, Reiner Georg: Untersuchungen über die Rolle von Matrix-Metalloproteinasen und deren Inhibitoren bei der demyelinisierenden murinen Theilervirus-Enzephalomyelitits mittels RT-qPCR. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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