Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung einer real-time multiplex multitube RT-PCR zur Differentialdiagnostik der Klassischen Schweinepest

Gavrilenko, Andreas

Classical swine fever (CSF) is an economically important viral disease of domestic pigs worldwide. It is notifiable to the OIE. The causative agent, classical swine fever virus (CSFV), is an enveloped RNA-virus which belongs to the family Flaviviridae, genus Pestivirus. The clinical picture is highly variable and often unspecific. For this reason, many other viral, bacterial and non-infectious diseases have to be considered as differential diagnoses. The diseases caused by viruses are African swine fever (ASF), porcine circovirus (PCV-2) infections, porcine parvovirus (PPV) infections, porcine influenza, porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), and Aujeszky´s disease (caused by suid herpesvirus type one, SHV-1). Diagnosis based on clinical signs alone is neither possible nor legitimate. As a consequence, a fast and reliable laboratory diagnosis is of utmost importance, both for surveillance and in case of an CSF outbreak. Polymerase chain reaction (PCR) is one of the fastest and most sensitive methods for the detection of viral genomes. The use of fluorescent labelled probes enables detection of multiple targets using multiplex real-time PCR. In this project a rapid and reliable test based on real-time multiplex reverse transcription (RT) PCR for differential diagnosis of CSFV was developed. Due to limitations of simultaneously detectable fluorescent dyes, the assay was designed as multitube test. The combination of pathogens within the assay was designed under consideration of pathogens’ specific characteristics and their relevance. The following combinations were selected: ASFV and SHV-1, PPV and PCV-2, porcine Influenza and Pestiviruses, as well as PRRSV strains. Beta-actin housekeeping gene was chosen as internal control. After designing specific primers and TaqMan probes, the realtime RT-PCRs were tested individually and subsequently optimized in the determined combinations. An already published real-time PCR for the detection and discrimination of American and European PRRSV strains (Kleiboeker et al., 2005) was integrated in the assay. For all PCR reactions a uniform thermal profile was developed. The assay was validated according to OIE validation criteria. The analytical sensitivity of the PCRs was determined and expressed as infectious units and/or genome equivalents. It proved to be superior or at least equivalent (for single PCRs) in comparison to virus isolation in cell culture. Specificity of primers and probes was assured by means of an extensive BLAST search. Clinical samples reflecting the genetic variability of the pathogens and the epidemiological situation, were included in the evaluation of the PCRs. The developed multiplex PCR provides a fast and reliable tool for differential diagnosis of CSF. The selected concept could be an important link in terms of exclusion of CSF without concrete epidemic suspicion. Furthermore, the uniform thermal profile offers the opportunity to include additional relevant PCR targets without affecting the other PCRs.

Die Klassische Schweinepest (KSP) ist eine wirtschaftlich bedeutende, anzeigepflichtige Tierseuche, deren Ausbrüche weltweit enorme wirtschaftliche Verluste verursachen. Die Erkrankung wird durch das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV), ein RNA Virus, das zum Genus Pestivirus der Virusfamilie Flaviviridae gehört, verursacht. Da das klinische Bild einer KSPV-Infektion sehr variabel und häufig unspezifisch ist, kommen viele andere Erkrankungen viraler, bakterieller und nicht-infektiöser Genese differentialdiagnostisch in Frage. Zu den viralen Differentialdiagnosen gehören die Afrikanische Schweinepest (ASP), porzine Circovirusinfektionen (PCV-2), porzine Parvovirusinfektionen (PPV), porzine Influenza, Infektionen mit dem porzinen respiratorischen und reproduktiven Syndrom Virus (PRRSV) und die Aujeszkysche Krankheit (SHV-1 Infektionen). Eine klinische Diagnose ist aufgrund der Vielzahl möglicher Differentialdiagnosen unmöglich und rechtlich als alleiniges Entscheidungskriterium der Seuchenfeststellung nicht zulässig. Sowohl für die routinemäßige Überwachung der Schweinepopulation als auch zur schnellen und verlässlichen Detektion und Kontrolle eines KSP-Ausbruchs ist daher eine moderne und effiziente Labordiagnostik von herausragender Bedeutung. Zu den schnellsten und empfindlichsten Methoden des Virusgenomnachweises gehört die Polymerasekettenreaktion (PCR), die es in so genannten multiplex Ansätzen zudem gestattet, verschiedene Erreger gleichzeitig, und bei Nutzung fluoreszierend markierter Sonden, in Echtzeit (”real-time“) zu detektieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer multiplex real-time PCR eine moderne und schnelle Nachweismethode differentialdiagnostisch relevanter viraler Erreger zu Pestivirusinfektionen entwickelt. Aufgrund der Anzahl der zu detektierenden Erregergenome erfolgte die Umsetzung in einem so genannten multitube Ansatz. Die Kombination der Erreger in den Ansätzen erfolgte unter Berücksichtigung der erregerspezifischen Eigenschaften und der Relevanz des Erregers. Für die PCR Ansätze wurden folgende Kombinationen gewählt: ASPV und SHV-1, PPV und PCV-2, porzine Influenza und Pestiviren sowie die beiden Stämme des PRRSV. Als interne Kontrolle wurde das housekeeping gene beta-Aktin gewählt. Nach der Entwicklung spezifischer Primerpaare und TaqMan-Sonden, wurden die entsprechenden real-time PCRs zunächst einzeln und dann in den vorgesehenen Kombinationen getestet und optimiert. Eine bereits publizierte real-time PCR zum Nachweis und zur Diskriminierung amerikanischer und europäischer PRRSV-Stämmen (Kleiboeker et al., 2005) wurde übernommen und in das Gesamtkonzept integriert. Alle PCR-Reaktionen wurden mit einem einheitlichen Thermoprofil durchgeführt. Die Validierung der neu etablierten PCRs erfolgte nach OIE Kriterien. Die analytische Sensitivität der PCRs wurde in infektiösen Einheiten bzw. Genomäquivalenten bestimmt und erwies sich im Vergleich zu dem Virusnachweis in Zellkultur als überlegen bzw. in Einzelfällen als gleichwertig. Die Spezifität der Primer und TaqMan-Sonden wurde mittels einer umfangreichen BLAST-Suche sichergestellt. Klinische Proben, welche die genetische Variabiltät der Erreger und die epidemiologische Situation widerspiegelten, wurden in die Testung der PCRs einbezogen. Der entwickelte PCR-Ansatz bietet die Möglichkeit einer schnellen und sicheren labordiagnostischen Differentialdiagnose der KSP. In der gewählten Konzeption könnte er zudem ein wichtiges Bindeglied darstellen, wenn es um den Ausschluss der KSP ohne konkreten Seuchenverdacht geht. Das vorliegende Konzept unter Verwendung eines einheitlichen Thermoprofils bietet zudem den Vorteil, dass das Testsystem beliebig um weitere relevante Erreger erweitert werden kann, ohne die restlichen Ansätze zu beeinflussen.

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Gavrilenko, Andreas: Entwicklung einer real-time multiplex multitube RT-PCR zur Differentialdiagnostik der Klassischen Schweinepest. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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