Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

DNA-Varianten in Zytokin codierenden Genen beim Schwein

Peischl, Tania

In this study, functionally significant genomic DNA regions of some porcine cytokine genes were analysed. For these regions, DNA variants were identified and evaluated for the distribution in breeds which are adapted to different locations. Within the experimental work, 90 genetic diverse pigs (from European Wild Boar, three European breeds, three local Vietnamese breeds and the Chinese breed Meishan) were included. For the interleukin genes 2, 6, 12B (IL-2, IL-6, IL-12B) and for the interferon-γ gene (IFN-γ) the EMBL data basis was screened for cDNA sequences of the pig (Sus scrofa). The sequences were compared with genomic sequences from Mus musculus, Homo sapiens and Bos taurus. Regions located 5’-flanking near the transcription start point (tsp) as well as within exon regions coding for functional important protein domains were sequenced by including DNA from 6 to 10 pigs of different breeds. Some of the thereby identified DNA variants were presented as RFLP. The analyses led to the following results: - Depending on the cytokine gene, the greatest homologies were elucidated in the 5’-flanking regions and in the exons. Homologies of up to 91 % were found in some of the 5’-flanking regions, especially near the tsp. Moreover, homologies of 90 % and higher were revealed between human, mouse, cattle and pig for the translated exon regions. Likewise as for other genes, this conservation is based either on the functional relevance or on the phylogenetic relationship. - In sequences defined in this study for the pig, similar response elements as in humans and mice were detected. The orthologous response elements are located at similar positions relative to the tsp. - Variants on 12 positions were found in the four cytokine genes by using DNA from different pig. Thus, regarding in total 2870 bp (without primer sequences) of sequenced DNA, a ratio of 0.42 % of nucleotide positions were detected to be polymorphic. Highly conserved regions were included and so the probability to find variants within a species was less than randomly. By analysing response elements and their corresponding transcription factors it was possible to evaluate the potential function of the identified DNA variants. - In total, six variable DNA positions were tested as RFLPs in animals of the population material. The polymorphic distribution of the DNA variants was verified for each of the positions. These results show that DNA variants found with the help of comparative sequencing in animals of different breeds are polymorphically distributed. Numerous DNA variants were newly provided for a central important group of genes, and these variants can be assumed to be located in functionally relevant gene regions. Therefore, all variants are candidates for veterinary and breeding orientated gene diagnostics regarding immune reactions and disease resistance in pig.

Mit den Forschungsarbeiten wurden funktionswichtige genomische DNA-Bereiche für einige porcine Zytokin-Gene untersucht. In diesen DNA-Regionen wurden überdies Varianten identifiziert und deren Verteilung in Schweinerassen, die an unterschiedliche Standorte angepasst sind, geprüft. In die experimentellen Arbeiten wurden 90 Schweine aus genetisch diversen Herkünften (Europäisches Wildschwein, drei europäische Rassen, drei vietnamesische Lokalrassen, die chinesische Rasse Meishan) sowie Nachkommen aus Rassenkreuzungen (F1-Kreuzungstiere aus Pietrain x Meishan sowie Large White x Meishan) einbezogen. Aus der EMBL-Datenbank wurden cDNA-Sequenzen des Schweines (Sus scrofa) für die Interleukin-Gene 2, 6, 12B (IL-2, IL-6, IL-12B) sowie das Inferferon-γ-Gen (IFN-γ) entnommen und mit genomischen Sequenzen von Mus musculus, Homo sapiens und Bos taurus verglichen. DNA-Bereiche, die 5’-seitig nahe dem Transkriptionsstartpunkt (tsp) lokalisiert sind, sowie Exonbereiche, welche funktionell wichtige Bereiche des Proteins codieren, wurden unter Einbeziehung der DNA von 6 - 10 Schweinen verschiedener Rassen vergleichend sequenziert. Einige der dadurch identifizierten DNA-Varianten wurden als RFLP dargestellt. Die Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: - Je nach Zytokin-Gen erschienen die größten Homologien in 5’-flankierenden Regionen und in den Exons. In einigen der 5’-flankierenden Bereiche gab es in der Nähe des tsp Homologien bis zu 91 %. Ebenfalls waren Homologien in den translatierten Exonbereichen zwischen Mensch, Maus, Rind und Schwein von 90 % und höher zu erkennen. Wie auch bei anderen Genen sind diese Homologien entweder auf eine funktionelle Bedeutung zurückzuführen oder aus der phylogenetischen Verwandtschaft zu erklären. - Bei den in den eigenen Untersuchungen sequenzierten porcinen Bereichen wurden ähnliche Response-Elemente wie bei Mensch und Maus nachgewiesen. Die orthologen Response-Elemente lagen zudem an sehr ähnlichen Positionen. - In den vier Zytokin-Genen wurden in verschiedenen Rassen Varianten an 12 Nukleotid-Positionen gefunden, was bei den insgesamt 2870 bp (ohne Primersequenzen) der sequenzierten DNA einen Anteil von 0,42 % an Positionen mit DNA-Varianten ergab. In dieser Studie wurden insbesondere die konservierten Genbereiche einbezogen, so dass die Wahrscheinlichkeit, innerhalb einer Spezies Varianten zu finden, niedriger als zufallsgemäß liegt. Mit Hilfe der Analyse von Response-Elementen und den darauf wirkenden Transkriptionsfaktoren war es möglich, Aussagen über die funktionelle Bedeutung der gefundenen DNA-Varianten zu machen. - Insgesamt sechs variable DNA-Positionen wurden als RFLPs am Populationsmaterial überprüft; in jeder dieser Positionen war eine polymorphe Verbreitung der DNA-Varianten festzustellen. Es zeigt sich also, dass DNA-Varianten, die durch vergleichende Sequenzierung an Tieren verschiedener Rassen gefunden werden, mit hoher Wahrscheinlichkeit polymorph verbreitet sind. Für eine zentral wichtige Gengruppe wurde mit den Untersuchungen eine große Zahl an DNA-Varianten bereitgestellt, die zudem in besonders funktionsrelevanten Gen-bereichen lokalisiert sind. Alle Varianten sind daher Kandidaten, die sich für eine veterinärmedizinisch-züchterische Gendiagnostik beim Schwein in Bezug auf Immunreaktionen und Krankheitsresistenz empfehlen.

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Peischl, Tania: DNA-Varianten in Zytokin codierenden Genen beim Schwein. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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