Einfluss einer Staupevirusinfektion auf die in vitro Expression von Matrix-Metalloproteinasen in Gehirnzellpopulationen adulter Hunde

Die Literaturübersicht gibt zu Beginn einen Überblick über den Zelltropismus und zytopathogenen Effekt des Staupevirus in kaninen neonatalen Gehirnzellkulturen. Die demyelinisierende Leukoenzephalitis (DLE) ist eine häufige Folge der Staupevirusinfektion und dient als Modell für andere demyelinisierende Erkrankungen. Im zweiten Abschnitt der Literaturübersicht wird auf die Expression der MMPs und ihrer Inhibitoren der TIMPs in glialen Kulturen der Spezies Mensch, Maus und Ratte eingegangen. MMPs sind Proteasen, die den Umbau der extrazellulären Matrix modulieren, reguliert von ihren endogenen Inhibitoren den TIMPs. Im ZNS wird ihnen daher als kritischen Mediatoren neuroinflammatorischer und neurodegenerativer Prozesse eine große Bedeutung zugesprochen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den frühen Einfluß der Staupevirusinfektion auf die Expression von MMPs und TIMPs in verschiedenen Gehirnzellkulturen des adulten Hundesgehirns qualitativ und quantitativ zu bestimmen. In einem ersten Schritt wurden zunächst Protokolle zur Kultivierung der empfindlichen adulten kaninen Gehirnzellen entwickelt und die gewonnenen Kulturen anhand zelltypspezifischer Marker charakterisiert. Als Material dienten hierzu die Gehirne von 12 Hunden im Alter von 8 Wochen bis 12 Jahren. Der qualitative und quantitative Nachweis von fünf MMPs (MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP–14) sowie zwei Inhibitoren (TIMP-1, TIMP-2) erfolgte auf mRNA-Ebene mittels RT-qPCR. Die proteolytische Aktivität der im Zellkulturüberstand enthaltenden Gelatinasen (MMP-2 und MMP-9) sowie der Kollagen umsetzenden Proteasen (MMP-3, MMP-12 und MMP-13) wurde mittels Zymographie untersucht. Der Western-Blot diente zur Identifikation der Proteine in den konzentrierten Zellkulturüberständen. Zur Infektion der Gliazellen stand ein zellkulturadaptierter, rekombinanter fluoreszenzmarkierter Staupevirusstamm (Ond-GFP) zur Verfügung. Die Mischkulturen und die gereinigten Mikroglia/Makrophagen-Kulturen von vier Tieren wurden jeweils in Dreifachansätzen mit einer MOI von 0,1 infiziert. Die Probennahme für die molekularbiologischen und zymographischen Untersuchungen erfolgte 24 und 72 Std p.i. Die Isolierung der Gehirnzellen von Hunden unterschiedlichen Alters war bis vier Std post mortem erfolgreich. Es wurden 0,9 x 106 Zellen/g Gehirn isoliert. Die gewonnen Mischkulturen, die nach der ersten Passage für die weiteren Versuche verwendet wurden, enthielten 15,5% A2B5-positive Zellen, interpretiert als Vorläuferzellen, 14,5% DiI-ac-LDL positive Mikroglia/Makrophagen, 4,3% GFAP-positive Astrozyten, 1,4% O4-positive Oligodendrozyten, 18 % schwach DiI-ac-LDL und Vimentin ko-exprimierende Zellen und 71,3% Vimentin-positive Zellen. Weiterhin wurden in serumfreien Kulturen A2B5 und p75NGFR-positive Zellen nachgewiesen. Durch Adaptierung eines in der Literatur für Nagerzellen beschriebenen Protokolls zum mechanischen Ablösen der Zellen gelang es, mehr als 91% reine Mikroglia/Makrophagenkulturen (Iba1/DiI-ac-LDL positive Zellen) des adulten Hundes zu etablieren. Auf Transkriptionsebene gelang in Mischkulturen und gereinigten Mikroglia/Makrophagenkulturen der Nachweis von MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP-14, TIMP-1 und TIMP-2 mRNA. In allen Kulturen waren MMP-12 und MMP-14 hoch- und TIMP-1 und MMP-13 niedrig-exprimierte Gene. Die beiden Kulturarten zeigten jedoch ein unterschiedliches Expressionsmuster. Die Mikroglia/Makrophagen-Kulturen exprimierten konstitutiv signifikant mehr MMP-9, MMP-12 und MMP-14 als die Mischkulturen, in denen neben MMP-12 und MMP-14 vorrangig MMP-2 detektiert wurde. Die Aktivität der Proenzymformen von MMP-2, MMP-9 und MMP-12 wurde mittels Gelatine- bzw. Kasein-Zymographie nachgewiesen. Im Western-Blot wurden die Proteine MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-12 und MMP-13 identifiziert. In den Infektionsversuchen waren 72 (24) Std p.i. 15,5% (1,8%) der Zellen in den Mischkulturen und 1,2% (0,17%) der gereinigten M Neben der Infektion von Astrozyten, Mikroglia/Makrophagen und Vimentin-positiven Zellen konnte eine bislang nicht beschriebene Infektion von A2B5/p75NGFR positiven Zellen nachgewiesen werden. In den Mischkulturen induzierte die Virusinokulation 24 Std p.i. auf mRNA-Ebene eine gegenüber den Kontrollkulturen signifikante 7fach erhöhte MMP-9 und 12fach erhöhte MMP-13 Expression und einen geringeren (1,4 bzw. 1,7fachen) Anstieg der MMP-2 und TIMP-1-mRNA-Expression. Auf Proteinebene war nach Infektion eine signifikant gesteigerte gelatinolytische Aktivität der Proenzyme pro-MMP-2 und pro-MMP-9 zu beobachten. Zudem wurde in den infizierten Mischkulturen die aktive Form von MMP-2 mittels Zymographie detektiert. In den gereinigten Mikroglia/Makrophagen-Kulturen wurden p.i. keine signifikanten Unterschiede der MMP- und TIMP-Expression festgestellt. In der vorliegenden Studie wurde somit nachgewiesen, dass nach Staupevirusinfektion eine Aufregulierung der MMPs in den Mischkulturen sowohl über die erhöhte Transkription, als auch über die Aktivierung der Zymogene erfolgte. Die Ergebnisse der in vitro Studie zeigten nach Virusinfektion eine signifikante Aufregulierung von MMP-2, MMP-9 und MMP-13 sowie ein erweitertes MMP-9/TIMP-1 und MMP-2/TIMP-2 Verhältnis. Dies lässt vermuten, dass diese Regulationen auch in vivo zu einer Imbalance des labilen Gleichgewichts zwischen MMPs und ihren Inhibitoren führen und damit möglicherweise zur Pathogenese der Demyelinisierung im Rahmen der DLE beitragen. Die Staupevirusinfektion schien im gewählten Zeitraum keinen direkten Einfluß auf die MMP-Expression der gereinigten Mikroglia/Makrophagen-Kulturen zu haben. Eine Beteiligung dieser Zellen an der Aufregulierung der MMPs in den Mischkulturen kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, sie ist das Thema weitergehender Untersuchungen.