Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss einer Staupevirusinfektion auf die in vitro Expression von Matrix-Metalloproteinasen in Gehirnzellpopulationen adulter Hunde

Krudewig, Christiane

In the literature section, the influence of a CDV infection on canine brain cell cultures is reviewed. The natural hosts of CDV are dogs and several other carnivores and a demyelinating leukoencephalitis (DLE) is a frequent sequal of CDV infection. The second chapter of the review gives a overview of the expression of MMPs and their inhibitors (TIMPs) in brain cell cultures of man, mouse and rat. MMPs are proteases, that modulate extracellular matrix turnover. Thus, they are known as critical mediators of neuroinflammatory und neurodegenerative processes in the CNS. TIMPs regulate proteolytic activity to prevent tissue damage. Therefore, the aim of this study was to determine the early influence of the CDV infection on the qualitative and quantitative MMP- and TIMP-expression in different cell cultures derived from adult canine brain using RT-qPCR and zymography. In a first step, protocols were established in order to develop cultures of the sensitive canine brain cells and furthermore to characterize them by cell-type specific markers. Brains of 12 dogs, 8 weeks to 12 years old, served as experimental material. The qualitative and quantitative expression of five MMPs (MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP-14) and two endogenous inhibitors (TIMP-1, TIMP-2) was determined on the mRNA level from cell lysates by RT-qPCR. Proteolytic activity of gelatinases (MMP-2 and MMP-9) and collagen degrading proteases in cell culture supernatants, were examined by zymography. Westernblot was used to identify proteins in concentrated supernatants. An attenuated recombinant green fluorescent protein-expressing CDV strain (Ond-GFP) was used for the infection of brain cell cultures. Mixed cultures and purified microglia/macrophage cultures of four animals were infected with a MOI of 0.1 in triplicates. Samples for molecular and zymographic analysis were taken at 24 and 72 hours p.i.The isolation of brain cells from dogs of different ages was successful up to four hours post mortem. 0.9x106 cells/g brain were isolated. Mixed cultures, used for further investigations after the first passage, contained 15.5% A2B5 positive cells, interpreted as progenitor cells, 14.5% DiI-ac-LDL positive microglia/macrophages, 4.3% GFAP-positive astrocytes, 1.4% O4-positive oligodendrocytes, 18% weakly- DiI-ac-LDL and Vimentin expressing cells and also 71.3% flat, vimentin–positive cells. Furthermore, A2B5 and p75NGFR expressing cells were detected in serumfree cultures. A purity of more than 91% of Iba1 and DiI-ac-LDL labeled cells was reached in microglia/macrophages cultures through successful adaptation of a protocol described in literature for mechanical separation of rodent cells. On the transcriptional level, MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP-14, TIMP-1 and TIMP-2 were expressed in mixed cultures and purified microglia/macrophages cultures. In all cultures, MMP-12 and MMP-14 were expressed on a high, and MMP-13 and TIMP-1 on a low level. However, cultures displayed a different pattern of expression. Microglia/macrophages expressed constitutively significantly more MMP-9, MMP-12 and MMP-14 than mixed cultures, where next to MMP-14 and MMP-12 predominantly MMP-2 was found. Using zymography in both culture systems pro-MMP-2 and pro-MMP-9 activity was constitutively and MMP-12 activity was irregularly detected. By western blot the proteins MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-12 and MMP-13 were confirmed. Virus inoculation resulted in infection of 15.5% (1.8%) in mixed cultures and 1.2% (0.17%) in purified microglia/macrophages after 72 (24) hours. In addition to the exspected infection of astrocytes, microglia/macrophages and vimentin positive cells, an infection of A2B5/p75NGFR positive cells was observed. In mixed cultures, the inoculation of the virus induced 24 hours p.i. a significantly higher mRNA-expression of MMP-9 (7fold) and MMP-13 (12fold) and a lower rise of MMP-2 (1.4fold) and TIMP-1 (1.7fold) -mRNA-expression. On the protein level, there was a significantly increased gelatinolytic activity of pro-MMP-2 and pro-MMP-9. Moreover, activity of MMP-2 was induced in infected mixed cultures. There were no significant changes in MMP- and TIMP-expression in purified microglia/macrophage cultures after virus inoculation. In summary, there was an up-regulation of MMPs in mixed cultures after an infection with CDV. It was demonstrated by an increased transcription as well as by activation of the zymogenes. The results of the in vitro study showed a significant up-regulation of MMP-2, MMP-9 and MMP-13 as well as an extended MMP-9/TIMP-1 and MMP-2/TIMP-2 relation. Presumably, these regulations also result in vivo to an imbalance of the delicate relationship between MMPs and their natural inhibitors TIMPs and consequently might play a role in the pathogenesis of demyelination in DLE. The inoculation of CDV did not seem to have an influence on the MMP-expression in purified microglia/macrophages cultures. A participation of these cells in the up-regulation of MMPs due to interaction of cells in mixed cultures can not be excluded, and will be the focus of further studies.

Die Literaturübersicht gibt zu Beginn einen Überblick über den Zelltropismus und zytopathogenen Effekt des Staupevirus in kaninen neonatalen Gehirnzellkulturen. Die demyelinisierende Leukoenzephalitis (DLE) ist eine häufige Folge der Staupevirusinfektion und dient als Modell für andere demyelinisierende Erkrankungen. Im zweiten Abschnitt der Literaturübersicht wird auf die Expression der MMPs und ihrer Inhibitoren der TIMPs in glialen Kulturen der Spezies Mensch, Maus und Ratte eingegangen. MMPs sind Proteasen, die den Umbau der extrazellulären Matrix modulieren, reguliert von ihren endogenen Inhibitoren den TIMPs. Im ZNS wird ihnen daher als kritischen Mediatoren neuroinflammatorischer und neurodegenerativer Prozesse eine große Bedeutung zugesprochen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den frühen Einfluß der Staupevirusinfektion auf die Expression von MMPs und TIMPs in verschiedenen Gehirnzellkulturen des adulten Hundesgehirns qualitativ und quantitativ zu bestimmen. In einem ersten Schritt wurden zunächst Protokolle zur Kultivierung der empfindlichen adulten kaninen Gehirnzellen entwickelt und die gewonnenen Kulturen anhand zelltypspezifischer Marker charakterisiert. Als Material dienten hierzu die Gehirne von 12 Hunden im Alter von 8 Wochen bis 12 Jahren. Der qualitative und quantitative Nachweis von fünf MMPs (MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP–14) sowie zwei Inhibitoren (TIMP-1, TIMP-2) erfolgte auf mRNA-Ebene mittels RT-qPCR. Die proteolytische Aktivität der im Zellkulturüberstand enthaltenden Gelatinasen (MMP-2 und MMP-9) sowie der Kollagen umsetzenden Proteasen (MMP-3, MMP-12 und MMP-13) wurde mittels Zymographie untersucht. Der Western-Blot diente zur Identifikation der Proteine in den konzentrierten Zellkulturüberständen. Zur Infektion der Gliazellen stand ein zellkulturadaptierter, rekombinanter fluoreszenzmarkierter Staupevirusstamm (Ond-GFP) zur Verfügung. Die Mischkulturen und die gereinigten Mikroglia/Makrophagen-Kulturen von vier Tieren wurden jeweils in Dreifachansätzen mit einer MOI von 0,1 infiziert. Die Probennahme für die molekularbiologischen und zymographischen Untersuchungen erfolgte 24 und 72 Std p.i. Die Isolierung der Gehirnzellen von Hunden unterschiedlichen Alters war bis vier Std post mortem erfolgreich. Es wurden 0,9 x 106 Zellen/g Gehirn isoliert. Die gewonnen Mischkulturen, die nach der ersten Passage für die weiteren Versuche verwendet wurden, enthielten 15,5% A2B5-positive Zellen, interpretiert als Vorläuferzellen, 14,5% DiI-ac-LDL positive Mikroglia/Makrophagen, 4,3% GFAP-positive Astrozyten, 1,4% O4-positive Oligodendrozyten, 18 % schwach DiI-ac-LDL und Vimentin ko-exprimierende Zellen und 71,3% Vimentin-positive Zellen. Weiterhin wurden in serumfreien Kulturen A2B5 und p75NGFR-positive Zellen nachgewiesen. Durch Adaptierung eines in der Literatur für Nagerzellen beschriebenen Protokolls zum mechanischen Ablösen der Zellen gelang es, mehr als 91% reine Mikroglia/Makrophagenkulturen (Iba1/DiI-ac-LDL positive Zellen) des adulten Hundes zu etablieren. Auf Transkriptionsebene gelang in Mischkulturen und gereinigten Mikroglia/Makrophagenkulturen der Nachweis von MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP-14, TIMP-1 und TIMP-2 mRNA. In allen Kulturen waren MMP-12 und MMP-14 hoch- und TIMP-1 und MMP-13 niedrig-exprimierte Gene. Die beiden Kulturarten zeigten jedoch ein unterschiedliches Expressionsmuster. Die Mikroglia/Makrophagen-Kulturen exprimierten konstitutiv signifikant mehr MMP-9, MMP-12 und MMP-14 als die Mischkulturen, in denen neben MMP-12 und MMP-14 vorrangig MMP-2 detektiert wurde. Die Aktivität der Proenzymformen von MMP-2, MMP-9 und MMP-12 wurde mittels Gelatine- bzw. Kasein-Zymographie nachgewiesen. Im Western-Blot wurden die Proteine MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-12 und MMP-13 identifiziert. In den Infektionsversuchen waren 72 (24) Std p.i. 15,5% (1,8%) der Zellen in den Mischkulturen und 1,2% (0,17%) der gereinigten M Neben der Infektion von Astrozyten, Mikroglia/Makrophagen und Vimentin-positiven Zellen konnte eine bislang nicht beschriebene Infektion von A2B5/p75NGFR positiven Zellen nachgewiesen werden. In den Mischkulturen induzierte die Virusinokulation 24 Std p.i. auf mRNA-Ebene eine gegenüber den Kontrollkulturen signifikante 7fach erhöhte MMP-9 und 12fach erhöhte MMP-13 Expression und einen geringeren (1,4 bzw. 1,7fachen) Anstieg der MMP-2 und TIMP-1-mRNA-Expression. Auf Proteinebene war nach Infektion eine signifikant gesteigerte gelatinolytische Aktivität der Proenzyme pro-MMP-2 und pro-MMP-9 zu beobachten. Zudem wurde in den infizierten Mischkulturen die aktive Form von MMP-2 mittels Zymographie detektiert. In den gereinigten Mikroglia/Makrophagen-Kulturen wurden p.i. keine signifikanten Unterschiede der MMP- und TIMP-Expression festgestellt. In der vorliegenden Studie wurde somit nachgewiesen, dass nach Staupevirusinfektion eine Aufregulierung der MMPs in den Mischkulturen sowohl über die erhöhte Transkription, als auch über die Aktivierung der Zymogene erfolgte. Die Ergebnisse der in vitro Studie zeigten nach Virusinfektion eine signifikante Aufregulierung von MMP-2, MMP-9 und MMP-13 sowie ein erweitertes MMP-9/TIMP-1 und MMP-2/TIMP-2 Verhältnis. Dies lässt vermuten, dass diese Regulationen auch in vivo zu einer Imbalance des labilen Gleichgewichts zwischen MMPs und ihren Inhibitoren führen und damit möglicherweise zur Pathogenese der Demyelinisierung im Rahmen der DLE beitragen. Die Staupevirusinfektion schien im gewählten Zeitraum keinen direkten Einfluß auf die MMP-Expression der gereinigten Mikroglia/Makrophagen-Kulturen zu haben. Eine Beteiligung dieser Zellen an der Aufregulierung der MMPs in den Mischkulturen kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, sie ist das Thema weitergehender Untersuchungen.

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Krudewig, Christiane: Einfluss einer Staupevirusinfektion auf die in vitro Expression von Matrix-Metalloproteinasen in Gehirnzellpopulationen adulter Hunde. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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