Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung über Axonopathien und die Rolle des Neurotrophins BDNF bei der kaninen Staupeenzephalitis

Seehusen, Frauke Antje

In the literature section, a short review about the classification of the morbillivirus genus, host spectrum and the pathogenesis of canine distemper virus infection and demyelinating distemper leukoencephalitis is provided. In addition, the present knowledge upon axonal structures and pathogenetic as well as molecular mechanisms of axonopathies, especially within demyelinating diseases in man and animals, are outlined. Furthermore, an overview on the role of the neurotrophin “brain-derived neurotrophic factor“ (BDNF) and its receptor tyrosine kinase B (TrkB) in neuroinflammatory processes is presented. The cerebella of 21 dogs, 17 of animals suffering from canine distemper leukoencephalitis and 4 healthy control dogs have been used in the present investigation. For histochemical and immunohistochemical investigations as well as in situ-hybridization formalin-fixed, paraffin-embedded tissue was used. A hematoxylin and eosin, a luxol fast blue cresyl echt violet and a modified Bielschowsky silver stain have been used. The latter was applied to investigate the morphology of axonal structures. Antibodies specific for astrocytes (GFAP), T- and B- lymphocytes (CD3 and CD79α), MHC class II-anigen (MHC-II), canine distemper virus nucleoprotein antigen (10H3), myelin basic protein (MBP), 2`,3`-cyclic nucleotide 3`-phosphodiesterase (CNPase), phosphorylated neurofilament (p-NF) as well as lysozyme, MAC 387 and the lectin BS-1 expressed by macrophages/microglia have been employed. Furthermore, an antibody against the mesenchymal marker vimentin was used. In addition, antibodies specific for detection of axonopathies like beta amyloid precursor protein (β-APP), non-phosphorylated neurofilament (n-NF) and ubiquitin were used. Furthermore, the expression of BDNF and TrkB was immunohistochemically investigated. The antisense probe of CDV-mRNA was used for detection of viral RNA by the in situ-hybridization. Additionally, immunohistochemical double-labelling was carried out on selected slides. The lesions in the cerebella of the diseased dogs, suffering from demyelinating distemper encephalitis and the healthy control animals were grouped into 8 classes by using neuropathology, immunohistochemical finding of canine distemper virus nucleoprotein antigen expression and in situ-hybridization for CDV-mRNA. The following characteristics for the groups were used for the following classification: control group (group 1), normal appearing white matter of distemper cerebella (group 2), animals with areas without microscopical lesions but detection of CDV-antigen (group 3), vacuolization (group 4), acute lesions (group 5), subacute lesions without inflammation (group 6), subacute lesions with inflammation (group 7) and chronic plaques (group 8). By immunohistochemistry and in situ-hybridization, distemper virus nucleoprotein antigen and mRNA was present in all distemper dogs and not in controls. GFAP-positive cells were detected in all groups, whereby a slight increase was noted in the early lesions, whereas in group 8-lesions a loss of intralesional cells with a marginal arrangement of remaining astrocytes was seen. Co-expression of GFAP and vimentin, verified by immunohistochemical double-staining, mainly in late lesions (group 6 to 8), was noted in astrocytes. The number of BS-1-positive macrophages/microglia increased from group 1 to 5, and the expression was most prominent in group 6 to 8. Similarly, there was a strong MHC class II-antigen up-regulation increasing from group 2 to 8. Only few MAC 387-positive macrophages were noted. In groups 6 to 8, a strong infiltration with lysozyme-, CD3- and CD79α-positive cells was observed. The signal for MBP and CNPase as well as for LFB was significantly decreased in plaques of groups 6 to 8. The immunohistochemical p-NF-signal was significantly reduced in group 6 to 8. By the modified Bielschowsky silver stain, detection of single spheroids and a significant decrease of axonal density in the white matter due to progression of lesion have been notified. The detection of β-APP, a marker for axonal damage, was found early in group 3 and reached its maximum in group 6 and 7. Damaged axons, which were positive for the non-phosphorylated neurofilament (n-NF), were detected mainly in groups 6 to 8. A significant increase of ubiquitin-positive cells of group 5 to 8, compared to group 3 and 4, was noticed. BDNF-expression was detected in distemper lesions in macrophages/microglia und mononuclear inflammatory cells, identified as CD3-positive lymphocytes, in lesions of group 5 to 8. Surprisingly, a strong signal of TrkB-positive macrophages/microglia with a maximun level in group 7 and 8 in lesions with severe demyelination was observed. Summarized, the provided data indicate that axonal damage occured early in canine distemper demyelinating leukoencephalitis and can be detected before myelin loss appeared. Using immunohistochemistry, β-APP seemed to be the most sensitive protein for early detection of axonal damage compared to other histochemical or immunohistochemical inverstigations. The paradigm of canine distemper leukoencephalitis as a primary demyelinating disorder should be reconsidered. It can be postulated that axonal damage plays an important role in the initial phase and during progression of canine distemper leukoencephalitis. Additionally, it can be suggested that BDNF and its receptor TrkB are involved in immune-mediated neuroprotective interactions in neuroinflammatory CDV lesions.

In der Literaturübersicht wird neben der Klassifikation der Morbilliviren und ihrem Wirtsspektrum und der Pathogenese der Hundestaupe eine kurze Zusamenfassung über die Pathogenese der Staupevirus-induzierten demyelinisierenden Leukoenzephalitis (DLE) des Hundes gegeben. Darüber hinaus werden anhand einer allgemeinen Übersicht die axonalen Strukturen und ihre histologische Darstellung sowie die Pathogenese von Axonopathien im Speziellen bei demyelinisierenden Erkrankungen von Mensch und Tier erläutert. Es folgt weiterhin eine Beschreibung der Bedeutung und der Wirkungsmechanismen des Neurotrophins “brain-derived neurotrophic factor“ (BDNF) und seines Rezeptors, der Tyrosinkinase B (TrkB) bei inflammatorischen Prozessen im Gehirn. Eingegangen in die Untersuchung sind die Kleinhirne von insgesamt 21 Hunden, von denen 17 an einer Staupeenzephalitis erkrankt waren und 4 einer klinisch gesunden Kontrollgruppe entstammten. Die histochemischen und immunhistologischen Untersuchungen sowie die in situ-Hybridisierung fanden an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Gehirngewebe statt. Hierbei wurden die Schnitte neben einer Hämatoxylin-Eosin (HE)- und einer Luxol Fast Blue-Kresylechtviolett (LFB-KEV)-Färbung zur Darstellung des Demyelinisierungsgrades auch einer modifizierten Silberfärbung nach Bielschowsky unterzogen, um die Morphologie axonaler Strukturen beurteilen zu können. Für die Immunhistologie wurden Antikörper zum Nachweis von Astrozyten (GFAP), T- und B-Lymphozyten (CD3 und CD79α), des MHC-Klasse-II-Antigens (MHC-II), des Staupevirus-Nukleoprotein-Antigens (10H3), des basischen Myelinproteins (MBP) und der “2`,3`-cyclic nucleotide 3`-phosphodiesterase“ (CNPase), von phosphoriliertem Neurofilament (p-NF) sowie Lysozym, MAC 387 und des Lektins BS-1 zum Nachweis von Makrophagen/Mikroglia verwendet. Zusätzlich wurde ein Antikörper zum Nachweis von Vimentin eingesetzt. Zur Darstellung axonaler Schädigungen kamen in der Immunhistologie Antikörper zum Nachweis des Amyloidvorläuferproteins (β-APP), des nicht-phosphorilierten Neurofilaments (n-NF) und Ubiquitin zur Anwendung. Weiterhin wurde die Expression des Neurotrohins BDNF und seines Rezeptors TrkB untersucht. Zusätzlich wurden an ausgewählten Schnitten immunhistologische Doppelmarkierungen vorgenommen. Mittels der in situ-Hybridisierung wurde eine Detektion Staupevirus-spezifischer mRNA mittels einer DIG-markierten “antisense”-Sonde durchgeführt. Die Kleinhirnläsionen der an einer demyelinisierenden Staupeenzephalitits erkrankten Hunde wurden anhand ihres histologischen Erscheinungsbildes sowie des immunhistologischen Nachweises von Staupevirus-Nukleoproteinantigen und der Detektion CDV-spezifischer mRNA und einschließlich der Kontrolltiere in 8 Gruppen eingeteilt. Hierbei entsprachen die Kontrolltiere der Gruppe 1, die “normal appearing white matter“ der Staupehunde der Gruppe 2, ein Antigennnachweis ohne offensichtliche Läsion der Gruppe 3, Vakuolisierungen wurden in Gruppe 4 eingeteilt, akute Herde in Gruppe 5, subakute Läsionen ohne Entzündung entsprachen der Gruppe 6, subakute Herde mit Entzündung wurden in Gruppe 7 und chronische Plaques in Gruppe 8 zusammengefasst. Mittels Immunhistologie wurde Staupevirus-Nukleoprotein-Antigen bei allen an Staupe erkrankten Tieren nachgewiesen, jedoch in unterschiedlicher Ausprägung und Intensität. In der in situ-Hybridisierung gelang der Nachweis der viralen mRNA mittels einer DIG-markierten Sonde bei allen Staupehunden. Intraläsionale GFAP-positive Zellen fanden sich in allen untersuchten Gruppen, wobei geringgradig erhöhte Astrozytenzahlen in den frühen Staupeläsionen vorlagen. In den chronischen Plaques war eine intraläsionale Reduktion von GFAP-positiven Zellen mit randständiger Anordnung der verbliebenen Astrozyten erkennbar. Die Koexpression von GFAP und Vimentin konnte in Astrozyten und hier vor allem signifikant erhöht in den späteren Läsionen (Gruppe 6 bis 8) nachgewiesen werden. BS-1-positive Makrophagen/Mikroglia waren von der Gruppe 1 bis 5 zunehmend, jedoch am stärksten in den Gruppen 6 bis 8 zu sehen, was auch mit einer deutlichen Aufregulierung des MHC-II-Antigens einherging. MAC 387-positive (“blood born“) Makrophagen wurden nur vereinzelt nachgewiesen, eine Erhöhung von Lysozym- sowie CD3- und CD79α-positiven Zellen war besonders in den Gruppen 6 bis 8 sichtbar. Die Expression von CNPase und MBP zeigte analog zur Abnahme der Anfärbbarkeit der weißen Substanz mit der LFB-KEV-Methode eine signifikante Abnahme der Myelinexpression bei den Gruppen 6 bis 8 im Vergleich zu den Gruppen 1 bis 5. Mittels der modifizierten Bielschowsky-Silberfärbung konnten neben einzelnen Sphäroiden eine progressive signifikante Verringerung der axonalen Dichte in der weißen Substanz der Staupehunde mit fortschreitendem Alter der Läsion festgestellt werden. Beim Nachweis des phosphorilierten Neurofilaments (p-NF) zeigte sich ebenfalls eine signifikante Reduktion des Signals in den Gruppen 6 bis 8 verglichen mit den Gruppen 3 bis 5. Bei der β-APP-Expression, die zur Detektion geschädigter Axone bereits in einem frühen Erkrankungsstadium (Gruppe 3, Antigennachweis ohne offensichtliche Läsion) führte, konnten maximale Werte in den Gruppen 6 und 7 nachgewiesen werden. n-NF-positive geschädigte Axone konnten im Gegensatz dazu besonders in den Gruppen 6 bis 8, also den späten Läsionen, festgestellt werden. Es zeigte sich eine stetige Zunahme Ubiquitin-exprimierender Zellen mit einer signifikanten Erhöhung in den Gruppen 5 bis 8 gegenüber den Gruppen 3 und 4. Bei der Untersuchung BDNF-positiver Zellen in den Läsionen der an Staupe erkrankten Hunde konnte neben einer neuronalen Expression auch ein Signal in Makrophagen/Mikroglia und perivaskulären, mononukleären Entzündungszellen vor allem in den späten Läsionen festgestellt werden. Ein außergewöhliches Vorkommen des Neurotrophin-Rezeptors TrkB konnte in Makrophagen/Mikroglia in demyelinisierenden Läsionen – verifiziert durch eine immunhistologische Doppelmarkierung – beobachtet werden, hierbei waren Maximalwerte in den Gruppen 7 und 8 zu erkennen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass axonale Schädigungen bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis des Hundes bereits sehr früh im Krankheitsverlauf – vor einer Demyelinisierung – detektiert werden konnten, wobei sich der immunhistologische Nachweis durch das β-APP-Antigen als am sensitivsten herausstellte. Es kann vermutet werden, dass ein großer Teil der klinischen motorischen und sensorischen Ausfallserscheinungen im Verlauf der Staupeerkrankung analog zur humanen MS durch diesen Umstand bedingt sein könnte. Durch die Tatsache, dass Axonschädigungen vor einer Entmarkung auftreten, muss das Paradigma von der Staupeleukoenzephalitis als eine primäre Entmarkungsenzephalitis überdacht werden. Weiterhin muss ein neuroprotektiver Aspekt der Entzündung diskutiert werden, da eine Expression des Neurotrophins BDNF und seines Rezeptors TrkB bei den neuroinflammatorischen Vorgängen in mononukleären Entzündungszellen im Rahmen der CDV-Infektion dargestellt werden konnte.

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Seehusen, Frauke Antje: Untersuchung über Axonopathien und die Rolle des Neurotrophins BDNF bei der kaninen Staupeenzephalitis. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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