Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular genetic analysis of congenital deafness in Dalmatian dogs

Rak, Simone Gerlinde

The objective of the present thesis was to select suitable candidate genes for congenital sensorineural deafness (CSD) in Dalmatian dogs, to map these genes to the canine genome, and to develop a candidate gene-associated marker set. This set of markers was intended for linkage analysis in order to identify among the large set of candidate genes those, for which involvement in the development of the disease is highly probable. A total of 24 human or murine candidate genes were selected that show an appropriate clinical and histological disease pattern in comparison to deafness in Dalmatians. For each candidate gene, one canine BAC clone was isolated by screening a canine BAC library with candidate gene-specific human or murine cDNA clones. The identity of the clones was confirmed by gene-specific heterologous hybridisation of the isolated canine BAC DNA and subsequent DNA sequencing of BAC fragments. BLAST searches of these canine sequences revealed significant matches to the corresponding human genes or to the human chromosomal regions flanking the corresponding genes. The 24 gene-containing BAC clones were assigned to 16 different canine chromosomes by FISH and RH mapping. Concordant results were obtained with these two independent methods. All assignments observed in this study were in good agreement with known synteny data from the established human-dog comparative map. The generated subclone sequences of the mapped BAC clones were used for the development of a set of new microsatellite-based markers. In total 43 candidate gene-associated markers (including 36 newly developed markers and 7 markers from the current RH map) were used for linkage analysis with CSD in an affected-pedigree-member design for German Dalmatian dogs. Significant linkage between the gene-associated markers and hearing loss was found for two of the 24 candidate genes investigated here. The observed result indicates that the inheritance of CSD in Dalmatians is at least digenic and probably even heterogenic. Moreover, the calculation of the respective haplotypes gives rise to the suspicion that even in related Dalmatian families mutations in different genes may cause the same deafness phenotype. An indirect genetic test for CSD in Dalmatians can now be performed using the CLDN14- and COL11A2-associated markers developed here and this test can be applied to dog breeding programmes. Complete sequencing of the two identified genes followed by analysis of mutations would provide information about the responsible deafness-causing mutations and the actual involvement of these genes in the disease. At the same time, these findings could be translated into the development of a direct genetic test for CSD in Dalmatians. This new set of markers offers the possibility of examining the potential involvement of the selected genes in CSD in Dalmatian populations world-wide. Furthermore, with this new marker set it is now even possible to genotype other dog breeds known to suffer from inherited sensorineural hearing impairment and to identify those candidate genes that significantly contribute to the diseased phenotype.

Einleitung Die kongenitale sensorineurale Taubheit ist eine Erkrankung, von der viele Säugetierspezies betroffen sind. Beim Hund werden über 54 verschiedene Rassen beschrieben, bei welchen ein kongenitaler Hörverlust gehäuft auftritt. In zahlreichen europäischen und amerikanischen Studien weisen hierbei die Dalmatiner mit 16,5-29,9% die höchste Taubheitsinzidenz auf. Die histologischen Veränderungen im Innenohr werden im allgemeinen als cochleo-sacculär beschrieben und können bei betroffenen Tieren schon direkt nach der Geburt diagnostiziert werden. Die Degenerationen im Innenohr schreiten mit zunehmendem Alter der Tiere fort und führen normalerweise spätestens in einem Alter von etwa vier Monaten zu einem vollständigen, ein- oder beidseitigen Hörverlust. Obwohl für den Dalmatiner die Erblichkeit der Erkrankung wiederholt nachgewiesen werden konnte, wurden für die verschiedenen untersuchten Dalmatinerpopulationen auch sehr viele unterschiedliche Erbgänge in Betracht gezogen. Es ist bisher nicht gelungen, die genaue Anzahl der beteiligten Gene zu bestimmen. Auch war es bislang für keine der betroffenen Hunderassen möglich, ein taubheitsverursachendes Gen zu identifizieren. Bei deutschen Dalmatinern ergab eine Auswertung mittels komplexer Segregationsanalysen, dass ein Modell mit einem rezessiven Hauptgen und einer polygenen Komponente das Auftreten der kongenitalen Taubheit in der untersuchten Population am besten erklärte. Zusätzlich konnte ein Zusammenhang zu Pigmentierungsgenorten nachgewiesen werden, da Tiere mit blauer Augenfarbe signifikant häufiger von Taubheit betroffen waren und gleichzeitig Tiere mit Plattenzeichnung seltener kongenitalen Hörverlust zeigten. In Deutschland gelten schon seit längerem ein- oder beidseitige Taubheit sowie blaue Augen als zuchtausschließende Fehler. Das bedeutet, dass alle Tiere, die eventuell in der Zucht eingesetzt werden sollen, zuvor mittels der Methode der akustisch evozierten Potentiale (AEP) auf ihr Hörvermögen untersucht werden müssen. Es hat sich allerdings gezeigt, dass allein diese Zuchtbestimmungen nicht genügen, um die hohe Taubheitsinzidenz beim Dalmatiner deutlich zu reduzieren. Da es sich für Hundebesitzer meistens als sehr schwierig darstellt, einen tauben Hund zu erziehen und entsprechend zu halten, werden fast alle Welpen mit bilateralem Hörverlust euthanasiert. Aus diesen Gründen scheint es nun dringend notwendig zu sein, die kongenitale sensorineurale Taubheit beim Dalmatiner molekulargenetisch zu untersuchen, um ein molekulargenetisches Testverfahren entwickeln und damit auch Anlageträger identifizieren zu können. Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurden auch zwischen relativ unverwandten Spezies, wie beispielsweise zwischen Mensch und Drosophila, die strukturellen und funktionellen Homologien auf genetischer Ebene zunehmend verdeutlicht. Aus diesem Grund kann bei Mensch und die Maus das Wissen über die schon aufklärten, taubheitsverursachenden Genmutationen verwendet werden, um die kongenitale sensorineurale Taubheit beim Dalmatiner möglichst effizient molekulargenetisch aufzuklären. Das Ziel dieser Dissertation ist es, geeignete humane oder murine Kandidatengene auszuwählen, diese beim Hund zu kartieren und ein kandidatengenassoziiertes Markerset zu entwickeln. Mit diesem Markerset soll dann eine potenzielle Kopplung der ausgewählten Kandidatengene mit der kongenitalen sensorineuralen Taubheit untersucht werden. Die Kandidatengene mit signifikanter Kopplung zur kongenitalen sensorineuralen Taubheit stehen dann für die weitere molekulargenetische Analyse zur Verfügung, um die kausalen Mutationen zu identifizieren. Die Ergebnisse dieser Studie sollen der molekulargenetischen Aufklärung der kongenitalen sensorineuralen Taubheit beim Dalmatiner und damit der Entwicklung eines Gentestes dienen. Material und Methoden Kandidatengenauswahl Beim Mensch und bei der Maus wurden bisher 32 Gene identifiziert, die einen ursächlichen Zusammenhang zur sensorineuralen, nicht syndromischen Taubheit aufweisen. 19 dieser Gene wurden aufgrund des vergleichbaren klinischen sowie histologischen Krankheitsbildes als Kandidatengene für die canine Taubheit ausgewählt. Da beim Dalmatiner auch eine Assoziation zu Pigmentierungsgenorten zu bestehen scheint, sollten des weiteren die fünf Gene, die für das menschliche Waardenburg-Syndrom kausal verantwortlich sind, in der Analyse berücksichtigt werden. Isolierung von caninen genomischen BAC-Klonen Für die 24 Kandidatengene wurden aus Internet-Datenbanken humane oder murine cDNA-Sequenzen ausgewählt, für die entsprechende IMAGE-Klone am RZPD Berlin zur Verfügung standen. Mit den 32P radioaktiv markierten Inserts dieser cDNA-Klone wurde, entsprechend der Standard RPCI-Protokolle, die canine genomische BAC-Genbank (RPCI-81) durchmustert. Nach Isolierung der BAC-DNA und Spaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen wurden die BAC-Klone zunächst über eine ECL-Hybridisierung mit den entsprechenden cDNA-Sonden verifiziert. Über eine Pulsfeldgelelektrophorese wurde die Größe der caninen genomischen DNA-Fragmente bestimmt. Die BAC-Klone wurden von beiden Rändern auf einem automatischen Sequenziergerät (LI-COR 4200L-2) ansequenziert. Diese Randsequenzen und Subklonsequenzen wurden mit bestehenden Datenbankeinträgen über die Programme BLAST und Ensembl Genome Server verglichen. Zur Identifizierung repetitiver Elemente (SINE, LINE) wurde das Programm Repeat Masker verwendet. Radiation Hybrid (RH) Kartierung Für jedes Kandidatengen wurde ein positiver BAC-Klon ausgewählt. Aus den Randsequenzen dieser Klone wurden Primer entwickelt, die über PCR an den Zelllinien des caninen RH Panels RHDF5000 typisiert und zu bereits kartierten Markern physikalisch angeordnet wurden. Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Software Multimap package über eine Zwei-Punkt-Analyse. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Für die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf GTG- und DAPI-gebänderten Chromosomen wurden canine Metaphasenchromosomen Phytohämagglutinin-stimulierter Blutlymphozyten eines gesunden Hundes genutzt. Die Präparation der Metaphasen erfolgte nach zytogenetischen Standardtechniken. Die DNA der BAC-Klone wurden über Nick-Translation mit Digoxigenin-11-dUTP, Spectrum Red dUTP, Spectrum Green dUTP, Spectrum Orange dUTP oder DEAC-dUTP markiert und auf den gebänderten caninen Chromosomen hybridisiert. Als Kompetitor, zum Binden repetitiver Sequenzen der markierten Klone, wurde gescherte genomische canine DNA und Lachssperma-DNA eingesetzt. Die Signale der hybridisierten Proben wurden mit dem Digoxigenin-FITC Detection Kit detektiert. Die Identifikation der Chromosomen erfolgte entsprechend der etablierten GTG- und DAPI-Bänderung des Hundes. Subklonierung der BAC-DNA und Markersuche Die kartierten caninen Klone wurden zur Subklonierung jeweils mit mindestens zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen gespalten, anschließend in den pGEM®-4Z Vektor ligiert und zur Kultivierung in kompetente XL1-blue E. coli transformiert. Von mindestens 48 Subklonen je Kandidatengen wurde dann die Plasmid-DNA isoliert und von beiden Rändern ansequenziert. Um Mikrosatelliten identifizieren und flankierende Primer entwickeln zu können, wurden diese jeweils etwa 700 bp umfassenden Sequenzen mit den Programmen Sequencher 4.0.5, Repeat Masker, und Primer3 Input bearbeitet. Genotypisierung Über PCR und Polyacrylamidgelelektrophorese wurden je Kandidatengen mindestens zwei neuentwickelte, möglichst polymorphe, genassoziierte Mikrosatellitenmarker an für Taubheit segregierenden Dalmatinerfamilien typisiert. Zusätzlich wurden einige, zu den Kandidatengenen gekoppelte Marker für die Genotypisierung verwendet. Die Daten wurden mit dem Softwarepaket SAS (Statistical Analysis System, Version 8.2) bearbeitet, um das Markerset bezüglich Allelfrequenzen, beobachteten (HO) und erwarteten (HE) Heterozygotiegrad und PIC (Polymorphism information content) charakterisieren zu können. Unter Verwendung der Software Merlin (multipoint engine for rapid likelihood inference, Version 0.9.10) wurde nach signifikanten, nicht parametrischen LOD-Scores für die Kosegregation von Markerallelen mit der phänotypischen Ausprägung der sensorineuralen Taubheit beim Dalmatiner gesucht. Ergebnisse Die 24 ausgewählten menschlichen Kandidatengene für die kongenitale sensorineurale Taubheit beim Dalmatiner, wurden sowohl mittels der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung als auch über das canine RH-Panel beim Hund kartiert. Für jedes Kandidatengen stimmten die chromosomalen Lokalisationen dieser beiden voneinander unabhängigen Methoden überein (Tabelle 1). Die Kartierungsergebnisse entsprachen alle den Syntäniebeziehungen zwischen Mensch und Hund in der aktuellen vergleichenden Genomkarte. Tabelle 1.       Ausgewählte Kandidatengene mit entsprechender humaner und caniner Lokalisation. Nr. Gen humane Lokalisation canine Lokalisation FISH RH 1 CDH23 10q21-q22 4q12-q13 4 2 CLDN14 21q22.3 31q15 31 3 COCH 14q11.2-q13 8q12-q13 8 4 COL11A2 6p21.3 12q11-q12 12 5 DFNA5 7p15 14q21.1 14 6 DIAPH1 5q31 2q23-q24.2 2 7 EDN3 20q13.2-q13.3 24q24-q25 24 8 EDNRB 13q22 22q21-q22 22 9 EYA4 6q23 1q13.3 1 10 GJA1 6q21-q23.2 1q24-q25 1 11 GJB2 13q11-q12 25q12-q21 25 12 GJB6 13q12 25q12-q21 25 13 MITF 3p14.1-p12.3 20q13 20 14 MYH9 22q12.3-q13.1 10q23.2 10 15 MYO6 6q13 12q21 12 16 MYO7A 11q13.5 21q13.3-q21 21 17 MYO15A 17p11.2 5q23-q24 5 18 OTOF 2p23.1 17q13 17 19 PAX3 2q35-q37 37q16-q17 37 20 POU4F3 5q31 2q21 2 21 SLC26A4 7q31 18q21 18 22 SOX10 22q13 10q21-q23 10 23 TECTA 11q22-q24 5q12-q13 5 24 TMPRSS3 21q22.3 31q15 31 Es wurden insgesamt 58 Mikrosatellitenmarker an Dalmatinerfamilien typisiert, wobei 50 Marker neu entwickelt waren und acht Marker der RH-Karte des Hundes entnommen wurden. Da sich einige Marker als homozygot, und daher als nicht informativ darstellten, konnten letztendlich 43 Marker (bestehend aus 36 neuentwickelten Markern und sieben Markern aus der RH-Karte) in der Analyse berücksichtigt werden. Das Markerset zeichnete sich durch eine durchschnittliche Allelanzahl von 3,5, einem PIC-Wert von 49%, einem HE von 50,3% und einem HO von 51% aus. Für insgesamt fünf Marker, die zu zwei der oben genannten Kandidatengene assoziiert sind, konnte eine signifikante Kopplung, mit Irrtumswahrscheinlichkeiten von p < 0,05, zu der kongenitalen sensorineuralen Taubheit festgestellt werden. Für weitere vier Marker, die für zwei andere Kandidatengene genotypisiert wurden, lagen die Irrtumswahrscheinlichkeiten noch bei p = 0,2. Anhand der berechneten Haplotypen konnte gezeigt werden, dass mit Ausnahme von einer einzigen Halbgeschwistergruppe, in allen untersuchten Dalmatinerfamilien entweder eines der identifizierten und signifikant gekoppelten Gene oder sogar beide Gene and der Entwicklung der Erkrankung beteiligt sein mussten. Diskussion Die Kombination des Kandidatengenansatzes mit der „affected-pedigree-member“ Methode In der vorliegenden Dissertation wurde ein Kandidatengenansatz mit der „affected-pedigree-member“ Methode zur Durchführung einer Kopplungsanalyse kombiniert. Aufgrund dieses neuen methodischen Ansatzes war es nicht notwendig, die genomische Struktur jedes einzelnen der 24 ausgewählten und kartierten Kandidatengene aufzuklären, sondern es müssen nun nur diejenigen Gene für weitere molekulargenetische Untersuchungen in Betracht gezogen werden, die eine signifikante Kopplung zu der kongenitalen Taubheit aufgewiesen haben. Durch die Entwicklung eines spezifischen kandidatengenassoziierten Markersets wurde die Möglichkeit einer Rekombination zwischen den Kandidatengenen und ihrer entsprechenden Marker weitestgehend minimiert. Daher war es möglich, die Kopplungsanalyse mit nur einem Bruchteil desjenigen Tiermaterials durchzuführen, welches für eine genomweite QTL-Studie erforderlich gewesen wäre. Die Kartierung Sowohl die Identität der isolierten kandidatengenenthaltenden Klone als auch die nachfolgenden Ergebnisse der Kartierungen wurden mit Hilfe zahlreicher unterschiedlicher Methoden überprüft. Die Kombination von der ECL-Hybridisierung mit dem Sequenzierung der BAC-Subklone und anschließendem Datenbankvergleich der Sequenzen, die Kartierung über zwei unabhängige Methoden, und letztendlich der Vergleich der Syntänieanaben zwischen Mensch und Hund, hat sich dabei als sehr wertvoll erwiesen. Die chromosomale Lokalisierung von 24 caninen Genen ist ebenfalls ein wertvoller Beitrag für die Entwicklung einer hochauflösenden vergleichenden Genkarte von Mensch und Hund. Das Markerset Im Vergleich zu den Ergebnissen anderer Markerstudien beim Hund konnte der Informationsgehalt des entwickelten Markersets mit einem PIC-Wert von 49% als ausreichend informativ bewertet werden. Da für eines der Kandidatengene kein Marker mit einem ausreichend hohen PIC-Wert typisiert werden konnte, kann für dieses Gen eine mögliche Kopplung zur kongenitalen Taubheit nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden. Es ist hier empfehlenswert, über das Sequenzieren weiterer Subklone neue Mikrosatellitenmarker zu entwickeln und zu testen. Dies wäre eventuell auch für die sieben Kandidatengene denkbar, für welche nur jeweils ein informativer Marker in die Studie einbezogen werden konnte. Mit dem entwickelten genassoziierten Markerset kann nun nicht nur weltweit bei allen Dalmatinerpopulationen, sondern auch bei allen anderen Hunderassen, die von kongenitaler sensorineuraler Taubheit betroffen sind, untersucht werden, ob eines oder eventuell mehrere der 24 ausgewählten Gene an der Krankheitsentwicklung ursächlich beteiligt sind. Die 36 neuentwickelten und physikalisch verankerten Marker dienen zudem der Verfeinerung der aktuellen RH-Karte des Hundes. Die Kopplungsstudie Die Ergebnisse der Kopplungsstudie ließen darauf schließen, dass mindestens zwei der untersuchten 24 Kandidatengene an der Entwicklung der kongenitalen sensorineuralen Taubheit in der untersuchten Dalmatinerpopulation beteiligt waren. Die beiden anderen Gene, deren Marker Irrtumswahrscheinlichkeiten von 0,2 erreichten, sind in Anbetracht des insgesamt untersuchten Tiermaterials, ebenfalls noch als mögliche Kandidaten in Erwägung zu ziehen. Es ist daher anzunehmen, dass die kongenitale sensorineurale Taubheit beim Dalmatiner digen, wahrscheinlich sogar heterogen bedingt ist. Ebenso wiesen die Haplotypberechnungen darauf hin, dass sogar innerhalb verwandter Dalmatinerfamilien unterschiedliche Gene für die Ausbildung desselben Krankheitsphänotyps verantwortlich sein können. Die signifikant gekoppelten Marker können bereits zur Durchführung eines indirekten Gentests verwendet werden. Über die Analyse der Haplotypen ist es mit diesem Gentest möglich, auf die hörenden Tiere zu selektieren, die das geringste Risiko haben, taubheitsverursachende Mutationen zu tragen und an ihre Nachkommen weiterzugeben. Um die Rolle der beiden identifizierten Gene bezüglich der Taubheit letztendlich aufklären zu können, sollten diese Gene vollständig sequenziert und daraufhin auf kausale Mutationen für die phänotypische Ausprägung der Erkrankung untersucht werden. Die Ergebnisse einer solchen Mutationsanalyse könnten dann ebenfalls der Entwicklung eines direkten Gentestes für die kongenitale sensorineurale Taubheit beim Dalmatiner dienen.

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Rak, Simone Gerlinde: Molecular genetic analysis of congenital deafness in Dalmatian dogs. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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