Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Cryopreservation of Mexican gray wolf (Canis lupus baileyi) semen

Zindl, Claudia

Recovery of the Mexican gray wolf (Canis lupus baileyi), a subspecies of the gray wolf (Canis lupus), depends on careful genetic management of the captive population. Because of their monogamous mating system, transfer of gametes using cryopreservation and artificial insemination is preferable to breaking pair-bonds and transfer of animals. As there are only few Mexican wolves available for evaluating the requisite technology, such as sperm cryopreservation, it has been necessary to use the generic gray wolf as a model and to base the techniques on those developed for the domestic dog, the wolf’s closest relative. The biggest loss of viable spermatozoa is reported to occur during the actual freezing and thawing, with minor changes during cooling and spermatozoa of several species require a rest of several hours during cooling, before freezing, to develop maximal resistance to the effects of freezing. The aim of the present study was to investigate the effects of various cooling rates and times in domestic dog (0.5 h, 1.5 h, 2.5 h, 3.5 h, 4.5 h) and generic and Mexican gray wolf (0.5 h, 1.0 h, 2.5 h) semen, including investigation of the effect of 1% Equex pasta on wolf semen quality. Semen collected by manual stimulation (dog) or electroejaculation (wolf) was cooled in different times and rates from room temperature to 5°C, in a refrigerator measuring the temperature decline with temperature sensors. 1% Equex pasta was added to the wolf semen before the freezing process, pelleted on dry ice and stored in liquid nitrogen. The influence of treatements was investigated by evaluation of motility, plasma membrane integrity and morphology by conventional spermatological methods in fresh, cooled and frozen-thawed semen and additional tools of semen evaluation such as computer-assisted analysis and electronmicroscopic analysis. In this study it is confirmed that pre-freeze cooling of dog and wolf semen cause both, loss of plasma membrane integrity and acrosomal damage, with further deterioration after freezing-thawing. In case of dog semen it is suggested to use a short cooling time (0.5 h) with a fast cooling rate (0.5 °C/min); for cryopreservation of generic and Mexican gray wolf semen, data from the present study support using a longer cooling time and a slow cooling rate of 0.08-0.1°C/min to reach refrigerator temperature (i.e. 5 °C). The addition of 1 % Equex pasta is not recommended. It would be of interest to investigate the effect of 0.5 % Equex STM paste or a different final concentration of Equex pasta and of different equilibration periods of the cooled semen samples to improve the wolf semen cryopreservation protocol.

Der Schutz vor dem Aussterben des mexikanischen Wolfes (Canis lupus baileyi), einer Unterart des nordamerikanischen Wolfes (Canis lupus) hängt von sorgfältigem genetischen Management der Population in Gefangenschaft ab. Augrund ihres monogamen Paarungssystems, ist die Übertragung von Keimzellen mittels Tiefgefrierkonservierung und künstlicher Besamung der Trennung von Wolfspaaren und dem Tiertransport vorzuziehen. Da nur noch wenige mexikanische Wölfe der erforderlichen Technologie, wie z.B. Spermatiefgefrierkonservierung, zur Verfügung stehen, wurde es nötig, den nordamerikanischen Wolf als Modell zu nutzen und sich auf diejenigen Techniken zu stützen, die für den Hund, den nächsten Verwandten des Wolfes, entwickelt wurden. Der größte Verlust an lebensfähigen Spermien entsteht während des eigentlichen Tiefgefrier- und Auftauprozesses, mit minimalen Veränderungen während der Kühlung. Einige Spezies benötigen eine Ruheperiode von mehreren Stunden während der Kühlung, vor dem Tiefgefrierprozess, um eine maximale Widerstandskraft gegen die Auswirkungen der Tiefgefrierkonservierung auszubilden.      Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Auswirkungen unterschiedlicher Kühlzeiten und –raten auf Spermien des Hundes (0.5 h, 1.5 h, 2.5 h, 3.5 h, 4.5 h) und der nordamerikanischen und mexikanischen Wölfe (0.5h, 1h, 2.5h) zu untersuchen, einschließlich der Auswirkung von 1% Equex pasta auf die Qualität des Wolfspermas. Durch manuelle Stimulation (Hund) und Elektroejakulation (Wolf) gewonnenes Sperma wurde in einem Kühlschrank mit unterschiedlichen Kühlzeiten und -raten von Raumtemperatur auf 5 °C gekühlt, währenddessen der Temperaturabfall mit Sensoren gemessen wurde. Vor dem Tiefgefrierprozess wurde der gekühlten Sperma-Verdünner-Suspension der Wölfe 1 % Equex pasta zugegeben, auf Trockeneis pelletiert und in flüssigem Stickstoff gelagert. Der Einfluss der Behandlungen wurde mit Hilfe konventioneller spermatologischer Methoden und zusätzlichen Instrumenten wie computergestützter Analyse und Elektronenmikroskopie in frischem, gekühltem und aufgetautem Sperma auf Motilitat, Plasmamembranintegrität und Morphologie untersucht. In dieser Studie wurde bestätigt, dass das Kühlen von Hunde- und Wolfsspermien vor dem Tiefgefrierprozess sowohl Verlust der Plasmamembranintegrität als auch Schaden der Akrosomenintegrität verursacht, mit einer weiteren Verschlechterung durch de Tiefgefrier- und Auftauprozess. Für die Tiefgefrierkonservierung von pelletierten Hundespermien empfiehlt sich eine kurze Kühlzeit (0.5 h) mit einer schnellen Kühlrate (0.5 °C/min); für die Tiefgefrierkonservierung von Wolfsspermien, unterstützen die Daten dieser Studie die Anwendung einer längeren Kühlzeit (2.5 h) und eine langsame Kühlrate von 0.08-0.1°C/min, bis zum Erreichen der Kühlschranktemperatur (z.B. 5 °C) vor dem Tiefgefrieren. Der Zusatz von 1 % Equex pasta wird nicht empfohlen. Es wäre interessant, die Auswirkung des Zusatzes von 0.5 % Equex STM paste oder von Equex pasta in einer anderen Endkonzentration  zu untersuchen, auch unterschiedlich lange Äquilibrierungsperioden der gekühlten Spermaprobe sollten getestet werden, zur Verbesserung des Tiefgefrierprotokolls für Wolfssperma.

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Zindl, Claudia: Cryopreservation of Mexican gray wolf (Canis lupus baileyi) semen. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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