Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Cloning and functional characterization of human nucleotide-sugar transporters

Ashikov, Angel Mladenov

The transport of nucleotide sugars from the cytoplasm into the Golgi apparatus is mediated by specialized type III proteins, the nucleotide sugar transporters (NSTs). Transport assays carried out in vitro with Golgi vesicles from mammalian cells, showed specific uptake for a total of eight nucleotide sugars, for activated sulfate (Adenosine 3'-phospho 5'-phosphosulfate, PAPS) and ATP. By phenotypic correction of biochemically characterized mutants several transporters have been identified and revealed that NSTs are type III membrane proteins with eight to ten trans-membrane domains (TMD). When this study was started, NSTs with transport activities for all but two nucleotide sugars (UDP-Xyl and UDP-Glc) had been cloned. Aiming at identifying these elusive NSTs, bioinformatics methods were used to display putative NST-sequences in the human genome. Twenty eight human and eight yeast open reading frames were selected as putative NSTs. Nine proteins were hetero- or homologeously expressed in yeast and transport capabilities for UDP-Glc and UDP-Xyl were determined with Golgi vesicles isolated from transformed cells. Vesicles from yeast cells expressing the human gene SLC35B4 showed specific uptake of UDP-Xyl and subsequent testing of other nucleotide sugars revealed a second activity for UDP-GlcNAc. Expression of the epitope-tagged SLC35B4 in mammalian cells, demonstrated strict Golgi localization. Because decarboxylation of UDP-GlcA is known to produce UDP-Xyl directly in the ER and Golgi lumen, our data suggest that two ways exist to deliver UDP-Xyl to the Golgi apparatus. While these studies identified the first UDP-Xyl transporter a, potential UDP-Glc transporter could not be found due to the high endogenous transport background present in S. cerevisiae. To identify this remaining activity and to search for a specific ATP transporter six yeast strains with defects in the SLC35 gene family were used as expression systems of candidate genes. Testing of prepared Golgi fractions demonstrated, however, that redundancy exists in the transport of these essential solute compounds and a single gene deletion is not enough to reduce the endogenous transport. Importantly, observations made in these assays are in excellent agreement with the lately identified multi-substrate specificity of many members in the SLC35 family, which clearly contrasts earlier biochemical data describing NSTs as mono-substrate specific. Low (better zero) -background systems are, therefore, needed to further investigate SLC35 family members. Towards this goal my subsequent studies were concentrated at generating and evaluating such systems. With SLC35B4 as model system reconstitution of recombinantly expressed protein in artificial proteoliposomes was tested. Because expression of the SLC35B4 protein in E. coli was not possible, purification of this recombinant protein after expression in S. cerevisiae was used but resulted in copurification of endogenous Golgi proteins and thus hampered the reconstitution experiments. Consequently, efforts were focused at cell free synthesis of SLC35B4. Using this method homogenous protein was obtained in sufficient concentration for reconstitution in true zero background systems. The reconstituted SLC35B4 confirmed specific transport for UDP-Xyl. However, the second transport activity for UDP-GlcNAc could not be detected in this system. Together, the results clearly demonstrate that the SLC35B4 protein is a human UDP-Xyl transporter. The second activity determined in the yeast system is, by all likelihood, formed in the cell by involvement of endogenous factors. The method newly developed in this study provides a crucial step forward should help to reevaluate transport specificities of know proteins and to characterize unknown members in the SLC35 family.

Zuckermonomere müssen in eine biologisch aktive Form gebracht werden, um Eingang in anabole Biosynthesewege zu erhalten. Die Aktivierung erfolgt durch die Herstellung von Zuckernucleotiden. Die Enzyme, die die Aktivierung der Zucker katalysieren, befinden sich hauptsächlich im Zytoplama der Zelle. D.h. auch ihre Produkte, die Zuckernucleotide fallen im Zytoplasma an. Glycosyltransferasen sind dagegen hauptsächlich im Golgi Apparat lokalisiert. Zur Überwindung der Membranbarriere existieren spezifische Transportsysteme, die sogenannten Zuckernucleotid Transporter (nucleotide sugar transporter, NST). Biochemische Analysen der Transportleistungen von Golgi Vesikeln hatten, in den 80er Jahren des vergangenen Jahrhunderts, acht NSTs mit unterschiedlichen Substratspezifitäten für Zuckernucleotide, das aktivierte Phosphat (Adenosine 3'-Phospho 5'-Phosphosulfat) und ATP identifiziert. Die ersten Klonierungen von NSTs gelangen 1996. In rascher Folge konnten in unabhängigen Laboratorien NSTs aus verschiedenen Spezies (Hefe, Maus, Hamster; Mensch) identifiziert werden. Der Weg zur Identifizierung war in allen Laboratorien identisch und bestand in der Komplementation von charakterisierten Zellmutanten. Das Vorliegen der NST Sequenzen machte klar, dass es sich hier um eine strukturell hoch konservierte Proteingruppe handelt. Alle identifizierten NSTs behielten nach Expression in heterologen Systemen volle Funktion. Zu Beginn dieser Arbeit, waren, mit Ausnahme der Transporter für UDP-Glucose und UDP-Xylose, alle im Golgi vorausgesagten NSTs kloniert. Die hohe Konservierung nutzend, begann die Suche nach den verbleibenden Aktivitäten mit einer Datenbankrecherche in der die bekannten Sequenzen als Matrizen dienten. Im humanen Genom wurden 28 und im Hefegenom 8 potentielle NST Sequenzen identifiziert. Alle humanen Gene gehörten in die family 35 of solute carriers (SLC35). Für den Vertreter SLC35B4 konnte auf diese Weise eindeutig eine Transportaktivität für UDP-Xylose nachgewiesen werden. Dagegen war, aufgrund der hohen endogenen Transportleistung der Hefevesikel, für keines der übrigen Gene eine spezifische Aktivität nachweisbar. Die weitergehende Charakterisierung des SLC35B4 zeigte neben der UDP-Xylose Transportaktivität der Golgi-Präparationen auch eine eindeutige Steigerung des Transports von UDP-N-Acetylglucosamin. Bestätigen ließ sich diese zweite Aktivität in Hefezellen, die einen genetischen Defekt im endogenen UDP-N-Acetylglucosamin Transport tragen und somit ein hintergrundfreies Testsystem zur Verfügung stellten. In der Summe erlaubten die durchgeführten Experimente den Schluss, dass das isolierte Gen SLC35B4 für einen bifunktionellen NST kodiert. Das erhaltene Ergebnis war in sehr guter Übereinstimmung mit parallelen Arbeiten, welche multiple Substratspezifitäten für mehrere NSTs zeigten. Die Charakterisierung weiterer Vertreter der SLC35 Familie auf dem eingeschlagenen Wege war jedoch aufgrund der hohen endogenen Transportaktivitäten der Hefen ausgeschlossen. Zur Etablierung eines alternativen Testsystems bestand mein nächstes Ziel darin, rekombinante Formen der NSTs herzustellen und als gereinigte Proteine in künstlichen Lipidmembranen zu rekonstituieren. Die so erzeugten Proteoliposomen sollten dann auf Transportaktivität getestet werden. Leider war die Expression der hydrophoben NSTs (Typ III Membranproteine) in Bakterien nicht erfolgreich. Der Versuch der Aufreinigung von epitopmarkierten NSTs nach Expression in Hefezellen war erfolgreich, die Testung wurde aber dadurch behindert, dass erhebliche Mengen an kontaminierendem Protein (vor allem NSTs) in den Fraktionen enthalten waren. In einem dritten Versuch wurde die Herstellung von NSTs im zellfreien System getestet. Mit SLC35B4 als Modellprotein wurden die Schritte optimiert und es konnten für die Durchführung der Transportassays ausreichende Mengen des NST in hoher Qualität erzeugt werden. In einem hintergrundfreien System konnte die UDP-Xylose Aktivität für SLC35B4 bestätigt werden. Transport für UDP-N-Acetylglucosamin war nicht sichtbar. Das Ergebnis erlaubte den Schluss, dass die zweite Aktivität im in vivo System erzeugt wurde. Vermutlich stellen im Golgi vorhandene NSTs (oder auch andere Faktoren) in Assoziation mit dem UDP-Xylose Transporter diese Aktivität her. Zusammenfassend kann damit gesagt werden, dass das neu etablierte Testsystem ein wichtiges Werkzeug für die Re-Evaluation bekannter NSTs und die Charakterisierung neuer Mitglieder der SLC35 Familie darstellt.

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Ashikov, Angel Mladenov: Cloning and functional characterization of human nucleotide-sugar transporters. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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