Cloning and functional characterization of human nucleotide-sugar transporters

Zuckermonomere müssen in eine biologisch aktive Form gebracht werden, um Eingang in anabole Biosynthesewege zu erhalten. Die Aktivierung erfolgt durch die Herstellung von Zuckernucleotiden. Die Enzyme, die die Aktivierung der Zucker katalysieren, befinden sich hauptsächlich im Zytoplama der Zelle. D.h. auch ihre Produkte, die Zuckernucleotide fallen im Zytoplasma an. Glycosyltransferasen sind dagegen hauptsächlich im Golgi Apparat lokalisiert. Zur Überwindung der Membranbarriere existieren spezifische Transportsysteme, die sogenannten Zuckernucleotid Transporter (nucleotide sugar transporter, NST). Biochemische Analysen der Transportleistungen von Golgi Vesikeln hatten, in den 80er Jahren des vergangenen Jahrhunderts, acht NSTs mit unterschiedlichen Substratspezifitäten für Zuckernucleotide, das aktivierte Phosphat (Adenosine 3'-Phospho 5'-Phosphosulfat) und ATP identifiziert. Die ersten Klonierungen von NSTs gelangen 1996. In rascher Folge konnten in unabhängigen Laboratorien NSTs aus verschiedenen Spezies (Hefe, Maus, Hamster; Mensch) identifiziert werden. Der Weg zur Identifizierung war in allen Laboratorien identisch und bestand in der Komplementation von charakterisierten Zellmutanten. Das Vorliegen der NST Sequenzen machte klar, dass es sich hier um eine strukturell hoch konservierte Proteingruppe handelt. Alle identifizierten NSTs behielten nach Expression in heterologen Systemen volle Funktion. Zu Beginn dieser Arbeit, waren, mit Ausnahme der Transporter für UDP-Glucose und UDP-Xylose, alle im Golgi vorausgesagten NSTs kloniert. Die hohe Konservierung nutzend, begann die Suche nach den verbleibenden Aktivitäten mit einer Datenbankrecherche in der die bekannten Sequenzen als Matrizen dienten. Im humanen Genom wurden 28 und im Hefegenom 8 potentielle NST Sequenzen identifiziert. Alle humanen Gene gehörten in die family 35 of solute carriers (SLC35). Für den Vertreter SLC35B4 konnte auf diese Weise eindeutig eine Transportaktivität für UDP-Xylose nachgewiesen werden. Dagegen war, aufgrund der hohen endogenen Transportleistung der Hefevesikel, für keines der übrigen Gene eine spezifische Aktivität nachweisbar. Die weitergehende Charakterisierung des SLC35B4 zeigte neben der UDP-Xylose Transportaktivität der Golgi-Präparationen auch eine eindeutige Steigerung des Transports von UDP-N-Acetylglucosamin. Bestätigen ließ sich diese zweite Aktivität in Hefezellen, die einen genetischen Defekt im endogenen UDP-N-Acetylglucosamin Transport tragen und somit ein hintergrundfreies Testsystem zur Verfügung stellten. In der Summe erlaubten die durchgeführten Experimente den Schluss, dass das isolierte Gen SLC35B4 für einen bifunktionellen NST kodiert. Das erhaltene Ergebnis war in sehr guter Übereinstimmung mit parallelen Arbeiten, welche multiple Substratspezifitäten für mehrere NSTs zeigten. Die Charakterisierung weiterer Vertreter der SLC35 Familie auf dem eingeschlagenen Wege war jedoch aufgrund der hohen endogenen Transportaktivitäten der Hefen ausgeschlossen. Zur Etablierung eines alternativen Testsystems bestand mein nächstes Ziel darin, rekombinante Formen der NSTs herzustellen und als gereinigte Proteine in künstlichen Lipidmembranen zu rekonstituieren. Die so erzeugten Proteoliposomen sollten dann auf Transportaktivität getestet werden. Leider war die Expression der hydrophoben NSTs (Typ III Membranproteine) in Bakterien nicht erfolgreich. Der Versuch der Aufreinigung von epitopmarkierten NSTs nach Expression in Hefezellen war erfolgreich, die Testung wurde aber dadurch behindert, dass erhebliche Mengen an kontaminierendem Protein (vor allem NSTs) in den Fraktionen enthalten waren. In einem dritten Versuch wurde die Herstellung von NSTs im zellfreien System getestet. Mit SLC35B4 als Modellprotein wurden die Schritte optimiert und es konnten für die Durchführung der Transportassays ausreichende Mengen des NST in hoher Qualität erzeugt werden. In einem hintergrundfreien System konnte die UDP-Xylose Aktivität für SLC35B4 bestätigt werden. Transport für UDP-N-Acetylglucosamin war nicht sichtbar. Das Ergebnis erlaubte den Schluss, dass die zweite Aktivität im in vivo System erzeugt wurde. Vermutlich stellen im Golgi vorhandene NSTs (oder auch andere Faktoren) in Assoziation mit dem UDP-Xylose Transporter diese Aktivität her. Zusammenfassend kann damit gesagt werden, dass das neu etablierte Testsystem ein wichtiges Werkzeug für die Re-Evaluation bekannter NSTs und die Charakterisierung neuer Mitglieder der SLC35 Familie darstellt.