Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der immunmodulatorischen Wirkung von Mistelpräparaten auf Zellen des Immunsystems von Rindern

Fischer, Angelika

Mistletoe preparations (Viscum album) have immunomodulatory properties for human and murine cells. Up to now, no studies have been performed with bovine immune cells. Therfore this work focuses on such effects concerning three different mistletoe preparations (ABNOBAviscum Mali-2, Fraxini-2 und Pini-2) containing varying contents of mistletoe lectins and viscotoxins. The investigations covered the induction of cellular death, cellular proliferation and other functional properties of bovine blood leukocytes (neutrophilic granulocytes, PMN, and mononuclear cells, MNC). Inhibition assays revealed that specific sugars compete with binding of mistletoe compounds, proving that mainly lectins account for the binding to bovine leukocytes. Labelling studies proved that mistletoe lectins bind with comparable affinity and strength to all bovine leukocyte subsets. Mistletoe products reduced significantly the numbers of viable bovine mononuclear cells. The most potent appeared to be V. Fraxini and V. Mali, killing the cells significantly at 0.15 µg/mL, followed by V. Pini (effective concentration: 150 µg/mL). Neither MNC monoculture nor in coculture with PMN had effects on the killing induced by V. Pini. In cocultures V.Fraxini and V. Mali revealed a cytotoxic effect at a concentration higher than 1.5 µg/mL. The cytotoxic effect could be inhibited significantly by mistletoe lectin-specific sugars. Cytotoxicity at 1.5 µg/mL affected significantly CD14+ monocytes and CD8+ T cells, and at higher concentrations (5µg/mL) also CD4+ T cells and nonT/non-B cells. In contrast none of the mistletoe products showed cytotoxic effects on PMN whether they were cultured alone or in combination with MNC. In addition, the generation of reactive oxygen species after receptor independent stimulation with phorbol myristate acetate was only moderately reduced by high concentrations of mistletoe products. No effects were seen on the Fc receptor-dependent stimulation with opsonised bacteria. The in vitro transmigration towards recombinant human CXCL8 remained largely unaffected, whether mistletoe products were used in combination with cells in the upper chamber or with rhCXCL8 in the lower chamber. Quantitative flow cytometric analysis did not reveal a proliferation-enhancing effect of subapoptotic mistletoe product concentrations for in vitro stimulated MNC. However, analysis of cellular division rates after carboxy-fluorescein-succimidyl-ester labelling revealed that a low V. Fraxini concentration (0.15 µg/mL) enhanced the cellular division rate for superantigen-, but not for mitogen-stimulated MNC. These still preliminary data are pointing towards a modulation of the T-cell receptor-mediated stimulation by mistletoe lectins. The observed effects on MNC are in part comparable to published findings in humans, whereas the complete lack of PMN modulation seems to be unique for cattle. The differential modulation of activation, proliferation and apoptosis of cells of the adaptive immune response indicate that mistletoe products interfere with key structures in activating and sustaining immunological responses in cattle – eventually advantageous as novel adjuvant compounds in vaccines or as mediators of immune polarization as successfully proved in murine models.

Mistelpräparate (Viscum album) besitzen immunmodulatorische Eigenschaften für humane und murine Zellen. Über die Wirkung von Mistelpräparaten auf bovine Immunzellen liegen noch keine Studien vor. In dieser Arbeit wurde daher der Einfluss von Mistelinhaltsstoffen auf Zellen des Immunsystems von Rindern geprüft. Die Beeinflussung von Absterbekinetik, Proliferationsverhalten und funktionellen Parametern boviner Leukozyten des peripheren Blutes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) und mononukleäre Zellen (MNC)) durch Mistelpräparate wurde untersucht. Zur Verfügung standen drei Mistelpräparate (ABNOBAviscum Mali-2, Fraxini-2 und Pini-2), die sich hinsichtlich ihres Gehaltes an Mistellektinen und Viscotoxinen unterscheiden. Bindungsstudien zeigten, dass FITC-markierte Mistelinhaltsstoffe mit gleicher Affinität an PMN, lymphoide und monozytoide Zellen des peripheren Blutes banden. Inhibitionsstudien mit spezifischen Zuckern belegten, dass in erster Linie Mistellektine für die Bindungsreaktionen an bovine Leukozyten verantwortlich waren. Ein funktioneller Einfluss auf die PMN konnte nicht gezeigt werden. Die Sterberate dieser Zellen wurde in Anwesenheit der verschiedenen Mistelpräparate in unterschiedlichen Konzentrationen in Reinkulturen von PMN oder in Mischkulturen aus PMN und MNC untersucht. Keines der drei geprüften Mistelpräparate konnte nach 22 h Inkubationszeit einen beschleunigten PMN-Zelltod induzieren. Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) nach rezeptorunabhängiger Stimulation mit Phorbol-Myristat-Acetat wurde nur in sehr hohen Konzentrationen schwach signifikant beeinflusst; Eine Beeinflussung der Fc-Rezeptor-abhängigen Stimulation mit opsonisierten Bakterien wurde nicht beobachtet. Auch das Migrationsvermögen der PMN, geprüft mit einem quantitativen Transmigrationsverfahren, wurde kaum beeinflusst. Dies war unabhängig davon, ob das Mistelpräparat zusammen mit Zellen oben, oder zusammen mit dem Chemokin (rhCXCL8) unten in der Transmigrationskammer eingesetzt wurde. Die Mistelpräparate reduzierten dosisabhängig stark die Zahl vitaler boviner mononukleärer Zellen in vitro. Am potentesten erwiesen sich die Präparate V. Fraxini und V. Mali, welche schon in einer Konzentration von 0,15 µg/mL die Anzahl vitaler Zellen signifikant reduzierten. V. Pini bewirkte erst in einer Konzentration von 150 µg/mL einen signifikanten Zellverlust. Ob MNC in Reinkultur oder zusammen mit PMN inkubiert wurden, hatte bei V. Pini auf die mistelinduzierte MNC-Absterbekinetik keinen Einfluss, V. Fraxini und V. Mali wirkten in Kokulturen erst ab 1,5 µg/mL zelltoxisch. Der zytotoxische Effekt konnte durch lektinspezifische Zucker gehemmt werden. Die Zytotoxizität bei 1,5 µg/mL betraf signifikant CD14+ Monozyten und CD8+ T-Zellen. Weniger empfindlich erwiesen sich CD4+ T-Zellen und nonT/non-B-Zellen, die erst ab 5µg/mL signifkant verstärkt abstarben. Die durchflusszytometrische, quantitative Analyse vitaler Zellen und Blasten nach in vitro Stimulation boviner MNC belegte zunächst keinen proliferationsfördernden Einfluss subapoptotischer Mistelpräparatkonzentrationen. Nach Analyse der Zellteilungsraten mit Hilfe Carboxy-Fluorescein-succimidyl-Ester-gefärberter MNC erwies sich eine V. Fraxini-Konzentration von 0,15 µg/mL als teilungsfördernd für Superantigen-, nicht jedoch für Mitogen (Concanavalin A)-stimulierte MNC. Dies deutet darauf hin, dass Mistellektine die T-Zellrezeptor-abhängige Stimulation modulieren können. Das beobachtete Wirkungsspektrum der untersuchten Mistelpräparate für bovine PMN und MNC weist teilweise deutliche Unterschiede zu humanen und murinen Zellen auf. Gemeinsam ist jedoch die subtile Beeinflussung der zellulären Aktivierung besonders in niedrigen Konzentrationsbereichen. Diese Eigenschaft lassen Mistelpräparate durchaus als geeignete Modulatoren einer Immunantwort oder als adjuvante Zusatzstoffe für Impfungen erscheinen, was bereits in murinen Modellen erfolgreich belegt wurde.

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Fischer, Angelika: Charakterisierung der immunmodulatorischen Wirkung von Mistelpräparaten auf Zellen des Immunsystems von Rindern. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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