Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Wirksamkeit oral applizierter Antikörper (produziert in transgenen Hefen und Erbsen) gegen enterotoxische Escherichia coli (ETEC) bei experimentell infizierten Absetzferkeln

Hagemann, Michael

Enterotoxic E. coli (ETEC) are responsible for most cases of diarrhoea in weaned piglets and they rank among the most important reasons for losses in piglets caused by infectious pathogens. The colonisation of the small intestine and secretion of enterotoxins is the cause of their pathogenicity. On the one hand, this research on 68 weaned piglets aimed to establish an adequate infection model (Ø age at time of infection: 44 d) with an ETEC strain (Ø 1010 cfu ETEC/animal), which forms F4-fimriae and produces enterotoxin LT1, ST1 and ST2. On the other hand, potential protective effects of oral application of antibodies (local passive immunisation; over a period of four till six days, starting the day before experimental infection) in experimentally infected weaned piglets were to be tested based on clinical and microbiological parameters. The orally applied antibodies (ab) are monoclonal with an affinity to F4-fimbriae of the ETEC strain and consist of variable regions of heavy and light chains of an immunoglobulin molecule (single chain fragment variable, scFv). Synthesis of ab was successful in transgenic yeasts (Pichia spec.) and peas with recombinant biotechnology by NOVOPLANT GmbH, Gatersleben. Moreover the fate of orally applied ab in the digestive tract (in-vivo) as well as after simulation of digestive environment (in-vitro) was of interest. Here the activity of ab was determined by their ability to attach to F4-fimbriae by ELISA and the stability of ab was shown by their molecule dimension as detected by Western-Blot. Success of experimental infection manifested itself in reduction of dry matter (DM) content in faeces (< 150 g/kg) in 20 (41.7 %) of 48 animals during the course of experimental infection. Presence of applied ETEC strain in faeces could be proved one day after experimental infection in 47 (97.7 %) of 48 animals. Observed parameters typically caused by ETEC induced secretory diarrhoea were significant (weakness, decrease of dry matter content in faeces [Ø 198 g/kg during massive faecal expulsion of applied ETEC] as was the increase of concentrations of sodium and chloride [in DM of faeces: Na: Ø 5.28 g/kg, Cl: Ø 4.97 g/kg during massive faecal expulsion of applied ETEC]). Moreover significant correlation was evident between levels of faecal expulsion of the applied ETEC and weakness (p=0.0003), interference of consistence of faeces (p<0.0001), decrease of dry matter content in faeces (p<0.0001) and increase of concentrations of sodium, potassium and chloride in dry matter of faeces (each p<0.0001). A positive effect could not be achieved by sole application of ab as “top dressing” on the diet during course of infection, which also stayed unaffected by the dose (4.63 – 40.3 mg ab/kg BW/d) or source (yeasts/peas) of ab. In weaned piglets continuously receiving (starting the day before experimental infection) a conventional diet containing 10 % transgenic peas (as a feed component) an infection could not be avoided, however lower intensity of interferences/variations was observed (Ø dry matter content of faeces during the day of experimental infection: 183 g/kg [no ab received; n=6], 215 g/kg [ab received via transgenic peas; n=3]). Further research on transgenic peas as a conventional diet component seems reasonable, yet was not possible in the framework of present research because of the lack of an adequate amount of such transgenic peas. Failure of examined oral application of ab to experimentally infected weaned piglets can be explained in essence by denaturation of ab in ingesta of the small intestine as shown by own investigations. While in-vitro about 60 % of ab (containing in transgenic peas) endure a simulated passage through stomach without damage, it was hardly able to prove their existence after a short-time incubation (seconds) in virgin ingesta of the small intestine. It is assumed, that a very rapid and almost complete denaturation by proteases is responsible for this. Coating auxiliary substances could protect from rapid proteolysis, this would however simultaneously avoid ab release and thus their attachment to pathogens. Therefore a continuous release of ab into the small intestine is necessary for the protective effect. Whether this release is already guaranteed by the “matrix” pea, has to be examined in clinical studies after experimental infection in context with advanced investigations on transgenic peas as a component of conventional diet. This proceeding requires adequate large amount of such transgenic peas, which however are not available at present.

Enterotoxische E. coli (ETEC) sind für einen Großteil der Durchfallerkrankungen bei Absetzferkeln verantwortlich und zählen zu den bedeutendsten Ursachen infektiös bedingter Ferkelverluste. Die Pathogenität oben genannter E. coli ist durch die Kolonisation des Dünndarms sowie durch die Bildung von Enterotoxinen bedingt. Ziel der Untersuchungen an insgesamt 68 Absetzferkeln war zum einen die Etablierung eines geeigneten Infektionsmodells an Absetzferkeln (Ø Infektionsalter: 44 Tage) mit ETEC (Ø 1010 KbE ETEC/Tier), welche sich durch die Bildung von F4-Fimbrien sowie der Enterotoxine LT1, ST1 und ST2 auszeichneten. Zum anderen erfolgte an experimentell infizierten (exp. inf.) Tieren eine Untersuchung möglicher protektiver Effekte einer oralen Antikörper-Applikation (lokale passive Immunisierung; über einen Zeitraum von vier bis sechs Tagen, beginnend am Vortag der exp. Inf.) anhand klinischer und mikrobiologischer Parameter. Bei den oral verabreichten Antikörpern (Ak) handelt es sich um monoklonale Ak, welche eine Spezifität zu F4-Fimbrien des Infektionsstamms besitzen und lediglich aus den variablen Regionen der schweren und leichten Ketten eines Immunglobulinmoleküls bestehen (single chain fragment variable, scFv). Mit Hilfe rekombinanter Biotechnologie gelang deren Synthese in transgenen Hefen (Pichia spec.) und Erbsen durch die Fa. Novoplant GmbH, Gatersleben. Des Weiteren interessierte das Schicksal der oral aufgenommenen Ak im Verdauungstrakt (in-vivo) bzw. nach Simulation des dortigen Milieus (in-vitro). Hierzu wurde die Ak-Aktivität durch Bestimmung des Bindungsvermögens an F4-Fimbrien mittels ELISA ermittelt sowie die Ak-Stabilität durch den Nachweis der Molekülgröße anhand eines Western-Blots geprüft. Der Erfolg der exp. Inf. äußerte sich in einem Rückgang der Trockensubstanz (TS)-Gehalte im Kot auf unter 150 g/kg bei 20 (41,7 %) von insgesamt 48 Tieren im Verlauf der exp. Inf.. Ein positiver Nachweis des Infektionsstamms gelang bei 47 (97,9 %) von 48 Tieren am Tag nach exp. Inf.. Die im Verlauf einer durch ETEC ausgelösten sekretorischen Diarrhö typischen Veränderungen nach exp. Inf. waren signifikant (gestörtes Allgemeinbefinden, Rückgang der TS-Gehalte im Kot [Ø 198 g/kg bei hgr. Keimausscheidung] sowie Anstieg der Na- und Cl-Konzentrationen [In der Kot-TS: Na: Ø 5,28 g/kg, Cl: Ø 4,97 g/kg bei hgr. Keimausscheidung]). Zudem wurde ein hochsignifikanter Zusammenhang zwischen dem Grad der fäkalen Ausscheidung des Infektionsstamms und der Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens (p=0,0003) und der Kot-Konsistenz (p<0,0001), einer Abnahme des TS-Gehalts im Kot (p<0,0001) sowie einem Anstieg der Na-, K- und Cl-Konzentrationen in der Kot-TS (jeweils p<0,0001) beobachtet. Unabhängig von der Antikörper-Dosis (4,63 – 40,3 mg/kg KM/d) und deren Herkunft (Hefen/Erbsen), konnte durch eine alleinige Applikation der Antikörper als „Top-Dressing“ über das Futter kein einziger positiver Effekt auf den Infektionsverlauf erreicht werden. Erhielten die Absetzferkel ab dem ersten Tag or der Infektion kontinuierlich ein Mischfutter mit 10 % transgenem Erbsenschrot, so wurde die Infektion zwar nicht verhindert, es war jedoch eine geringere Intensität der Störungen/Veränderungen erkennbar (Ø TS-Gehalte im Kot am Tag der exp. Inf.: 183 g/kg [keine Ak, n=6], 215 g/kg [Ak in Erbsenschrot; n=3]). Eine Fortführung der Untersuchungen mit transgenem Erbsenschrot als Mischfutterbestandteil, erscheint daher sinnvoll, war jedoch hier mangels verfügbarer Massen an entsprechenden transgenen Erbsen nicht möglich. Der ausbleibende Erfolg der hier geprüften oralen Applikation von Ak bei exp. inf. Ferkeln erklärt sich nach eigenen Untersuchungen im Wesentlichen mit der Denaturierung der Ak im Dünndarmchymus. Während in-vitro etwa 60 % der in transgenem Erbsenschrot enthaltenen Antikörper eine simulierte Magenpassage unbeschadet überstanden, war deren Nachweis nach nur kurzzeitigem Aufenthalt (Sekunden) in nativem Dünndarmchymus kaum mehr möglich. Als Ursache hierfür wird eine sehr schnelle und nahezu vollständige Denaturierung durch Proteasen vermutet. Zwar bieten ummantelnde Hilfsstoffe einen Schutz vor einer raschen Proteolyse, doch verhindern diese gleichzeitig eine Antikörper-Freisetzung und somit deren Bindung an Pathogene. Eine stetige Antikörper-Freisetzung innerhalb des Dünndarms ist daher für einen protektiven Effekt unabdingbar. Die Klärung der Frage, ob eine solche verzögerte Freisetzung bereits durch die „Matrix“ Erbse gewährleistet ist, erfordert klinische Studien nach exp. Inf. in Verbindung mit einer weitergehenden Prüfung des Erbsenschrots als Mischfutterbestandteil. Dieses Vorgehen setzt entsprechend größere Mengen an oben genannten transgenen Erbsen voraus, an denen es derzeit jedoch mangelt. der TS-Gehalte im Kot [Ø 198 g/kg bei hgr. Keimausscheidung] sowie Anstieg der Na- und Cl-Konzentrationen [In der Kot-TS: Na: Ø 5,28 g/kg, Cl: Ø 4,97 g/kg bei hgr. Keimausscheidung]). Zudem wurde ein hochsignifikanter Zusammenhang zwischen dem Grad der fäkalen Ausscheidung des Infektionsstamms und der Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens (p=0,0003) und der Kot-Konsistenz (p<0,0001), einer Abnahme des TS-Gehalts im Kot (p<0,0001) sowie einem Anstieg der Na-, K- und Cl-Konzentrationen in der Kot-TS (jeweils p<0,0001) beobachtet. Unabhängig von der Antikörper-Dosis (4,63 – 40,3 mg/kg KM/d) und deren Herkunft (Hefen/Erbsen), konnte durch eine alleinige Applikation der Antikörper als „Top-Dressing“ über das Futter kein einziger positiver Effekt auf den Infektionsverlauf erreicht werden. Erhielten die Absetzferkel ab dem ersten Tag vor der Infektion kontinuierlich ein Mischfutter mit 10 % transgenem Erbsenschrot, so wurde die Infektion zwar nicht verhindert, es war jedoch eine geringere Intensität der Störungen/Veränderungen erkennbar (Ø TS-Gehalte im Kot am Tag der exp. Inf.: 183 g/kg [keine Ak, n=6], 215 g/kg [Ak in Erbsenschrot; n=3]). Eine Fortführung der Untersuchungen mit transgenem Erbsenschrot als Mischfutterbestandteil, erscheint daher sinnvoll, war jedoch hier mangels verfügbarer Massen an entsprechenden transgenen Erbsen nicht möglich. Der ausbleibende Erfolg der hier geprüften oralen Applikation von Ak bei exp. inf. Ferkeln erklärt sich nach eigenen Untersuchungen im Wesentlichen mit der Denaturierung der Ak im Dünndarmchymus. Während in-vitro etwa 60 % der in transgenem Erbsenschrot enthaltenen Antikörper eine simulierte Magenpassage unbeschadet überstanden, war deren Nachweis nach nur kurzzeitigem Aufenthalt (Sekunden) in nativem Dünndarmchymus kaum mehr möglich. Als Ursache hierfür wird  ine sehr schnelle und nahezu vollständige Denaturierung durch Proteasen vermutet. Zwar bieten ummantelnde Hilfsstoffe einen Schutz vor einer raschen Proteolyse, doch verhindern diese gleichzeitig eine Antikörper-Freisetzung und somit deren Bindung an Pathogene. Eine stetige Antikörper-Freisetzung innerhalb des Dünndarms ist daher für einen protektiven Effekt unabdingbar. Die Klärung der Frage, ob eine solche verzögerte Freisetzung bereits durch die „Matrix“ Erbse gewährleistet ist, erfordert klinische Studien nach exp. Inf. in Verbindung mit einer weitergehenden Prüfung des Erbsenschrots als Mischfutterbestandteil. Dieses Vorgehen setzt entsprechend größere Mengen an oben genannten transgenen Erbsen voraus, an denen es derzeit jedoch mangelt.

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Hagemann, Michael: Untersuchungen zur Wirksamkeit oral applizierter Antikörper (produziert in transgenen Hefen und Erbsen) gegen enterotoxische Escherichia coli (ETEC) bei experimentell infizierten Absetzferkeln. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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