Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Expression des Hauptstrukturproteins des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus in transgenen Pflanzen

Hammer, Martin

The project Sustainable Production of Vaccines Against Viral Pathogens Using Transgenic Plants is described. The gene coding sequence of Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV) capsid protein (VP60) was used to generate VP60 expressing plants for immunization tests. Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV) is a calicivirus that induces severe symptoms in rabbits and is associated with a high mortality rate. Vaccines offer protection but liver material from experimentally RHDV infected rabbits is necessary for vaccine production. Genetically engineered subunit vaccines are showed to be effective but are not market-ready. The production of VP60 expressing plants could serve as an alternative solution and offer animal welfare advantages (elimination of vaccine production in animals).   The main focus of this project was the analysis of translation products expressed in the plants Nicotina tabacum (tobacco), Solanum tuberosum (potato) and  Daucus carota (carrot). The effect of plant adapted VP60 codon usage was examined. Multiple VP60 constructs containing the Endoplasmic Reticulum Retention Signal (SEKDEL), the mucosal adjuvants Cholera toxin Subunit B (ctxB) and ctxB VP60 fusion proteins with and without the secretoric pathway supporting signal peptide (sig) were created and analysed. These constructs were under control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) promoter (35S); selected constructs under control of the Granule Bound Starch Synthetase (GBSS) promoter were also implemented with capsid protein expression concentrated in potato tubers. Sixty-nine tobacco lines including 6 different constructs, 193 potato lines including 7 different constructs and 19 carrot lines including one construct were analysed. The results showed that -         expression of RHDV capsid protein VP60 in detectable level (ELISA, Western Bot) is possible in tobacco, potato and carrot plants. -         construction of plant adapted VP60 codon usage revealed a much stronger protein expression compared to the unmodified VP60 open reading frame. -         lower protein expression levels were found in ctxB_VP60 constructs compared to constructs containing ctxB (VP60, VP60SEKDEL). -         expression was dependent on plant type and variety. Potatoes of the variety Desirée and tobacco revealed higher VP60 protein expression levels compared to the potato variety Albatross. Carrots of the variety Rotin showed increased expression compared to the variety Rote Riesen.             Rabbits and mice were immunized orally and parenterally with material of selected plants. No plant, regardless of construct, formulation and quantity was shown to be immunogenic. Protection could not be achieved against a challenge infection with RHDV. Oral adinistration of inactivated RHDV-positive liver material and and Baculovirus expressed VP60 did not confer protection against RHDV challenge infection in rabbits. Parenteral adminstration of 8,6 ng Baculovirus vaccine (expressed via VP60) per immunizion dose was shown to be protective against RHDV, while 450 ng plant vaccine (expressed via VP60) per immunization dose was not shown to afford immunity.   The unmodified and synthetic VP60 open reading frames under control of the Murine Cytomegaly Virus (MCMV) promoter (pie) were expressed transient in mammalian cell lines, namely Crandle Renal Kidney Cells (CRFK). -         The expression of RHDV capsid protein VP60 in CRFK cells is possible with wild-type and synthetic VP60 constructs. -         Cytoplasmic VP60 products (VP60 wt, VP60, VP60SEKDEL) revealed higher expresion levels compared to ctxB_VP60 fusion proteins. -         Parenteral application of transgenic cell suspension showed a specific immune reaction dependent on the applicated VP60 quantity.   In addition to antigen quantity, qualitative antigenic properties such as the physical and chemical conditions of the antigen are important for conferring immunity. Attempts to achieve immunity with plant derived antigens were more difficult than anticipated. Many factors such as plant type, antigen construct, promoter, harverst method and application route influence immunity.

In der vorliegenden Arbeit werden anteilige Ergebnisse aus einem Verbundprojekt mehrerer Partner über die „Nachhaltige Produktion von Impfstoffen gegen virale Krankheitserreger in transgenen Pflanzen“ vorgestellt. Das Ziel bestand darin, den für das Kapsidprotein (VP60) des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV) kodierenden Genabschnitt in Pflanzen zu übertragen, um auf diese Weise Pflanzen zu generieren, die das VP60 exprimieren und für Immunisierungsversuche eingesetzt werden können. Das RHDV, ein Vertreter aus der Familie der Caliciviridae führt zu schweren, meist letal verlaufenden Erkrankungen bei Haus- und Wildkaninchen. Eingesetzte Impfstoffe basieren auf Leberhomogenaten infizierter Kaninchen, gentechnisch hergestellte Subunitvakzine sind im Experiment erprobt, jedoch nicht bis zur kommerziellen Reife entwickelt. Die Produktion immunogener Proteine über Pflanzen stellt eine mögliche alternative Lösung dar. Die Expression des VP60 über transgene Pflanzen hat somit Modellcharakter für die Herstellung von Immunogenen aus nachwachsenden Rohstoffen, trägt im konkreten Fall zudem den Erfordernissen des Tierschutzes Rechnung (Ablösung der Impfstoffherstellung am Tier) und ist wegen der Spezifik des gewählten Modells (Vorhandensein von nur einem protektiven Protein, etabliertes Prüfmodell) von allgemeiner Aussagekraft. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag auf der Analyse der Translationsprodukte von Pflanzen (Tabak Nicotina tabacum, Kartoffel Solanum tuberosum und Karotte Daucus carota). Insgesamt wurden 69 Tabaklinien von sechs Konstrukten, 193 Kartoffellinien von sieben Konstrukten und 19 Karottelinien von einem Konstrukt in die Analysen einbezogen. Die erhaltenen Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: -         Prinzipiell gelang es, in Tabak, Kartoffeln und Karotten, das Kapsidprotein des RHDV in nachweisbaren Mengen (ELISA, Western Blot) zu exprimieren. -         Erst durch die Anpassung der gewählten synthetischen Leserahmen an die pflanzliche Kodonpräferenz gelang der Antigennachweis im ELISA. -         Die Konstruktion von ctxB_VP60 Fusionsproteinen ergab eine geringere Syntheserate als ohne ctxB (VP60, VP60SEKDEL). -         Sowohl Pflanzenart als auch -sorte haben Einfluss auf die Expressionshöhe. Tabak und Kartoffeln der Sorte „Desireé“ wiesen insgesamt höhere Expression an VP60 auf als Kartoffeln der Sorte „Albatros“, ebenso wie Karotten der Sorte „Rotin“ besser eprimierten als „Rote Riesen“.   Ausgewählte Pflanzen wurden in Tierversuchen auf ihre immunogene Wirkung nach parenteraler und oraler Verabreichung an Mäuse und Kaninchen untersucht. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: -         Mit keiner der eingesetzten Pflanzen, unabhängig von der Menge und Verabreichungsform, konnte eine spezifische Immunantwort erzielt werden. -         Gegen eine experimentelle RHDV Infektion bei Kaninchen konnte kein Schutz erreicht werden. Eine orale Verabreichung, auch großer Mengen aus inaktiviertem Lebermaterial bzw. durch Bakulovirusexpression generierten VP60 an Kaninchen führte zu keinem Schutz vor einer experimentellen RHDV Infektion, was die limitierten Möglichkeiten einer oralen Immunisierung mit inaktivierten Antigenen unterstreicht. Nach parenteraler Immunisierung mit VP60 aus Bakuloviren wurde die minimal schützende Dosis mit 8,6 ng VP60/Impfdosis bestimmt, während 450 ng VP60/ Impfdosis  aus transgener Kartoffel nicht protektiv wirkte. Die Wildtyp (wt) und pflanzenadaptierte VP60-Leserahmen, unter der Kontrolle des Promotors (pie) des murinen Zytomegalievirus (MCMV), wurden in Säugerzellen (CRFK) zur transienten Expression des Kapsidproteins verwendet. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: -         Die Expression von RHDV Kapsidprotein ist durch Wildtyp- und pflanzenadaptierte Leserahmen in Säugerzellen (CRFK) möglich. -         Es konnte in der Expressionshöhe eine Präferenz der zytoplasmatisch exprimierten VP60 Konstrukte (VP60 wt 2/18, VP60, VP60SEKDEL) gegenüber den ctxB-VP60 Fusionsproteinen festgestellt werden. -         Nach parenteraler Applikation VP60 enthaltender transgener Zellsuspension konnte eine spezifische Immunantwort beobachtet werden, die jedoch nicht mit der Menge applizierten Antigens korrelierte. Dies zeigt, dass neben quantitativen, vor allem qualitative Eigenschafen, wie der physikochemische Zustand des Antigens für die Erzeugung einer Immunität von Bedeutung sind.

Zitieren

Zitierform:

Hammer, Martin: Expression des Hauptstrukturproteins des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus in transgenen Pflanzen. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export