Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunreaktion im Kalb auf das rekombinante Major Sperm Protein von Dictyocaulus viviparus als Glutathion-S-Transferase Fusionsprotein

Holtum, Christian

At present the only registrated vaccine against D. viviparus is a X-ray attenuated life-vaccine. During testing biotechnologicaly produced vaccines, immunisation trials with recombinant MSP from D. viviparus were done to investigate the immunogenic and protective properties of this protein. Furthermore, an ELISA was developed for serodiagnosis of lungworm infections and the stage- and sexspecific transcription of MSP was demonstrated in lungworms. The cDNA sequence coding for the MSP of D. viviparus was cloned into a procaryotic plasmid vector and expressed in E. coli as GST-fusionprotein. Afterwards the recombinant protein was purified using affinity chromatography reaching at least 93 % purity. Following identification of the MSP in MALDI-TOF, the antigen was used in immunisation trials in calves and in ELISA. There was an initial rise of specific IgA, IgM, IgG, IgG1 and IgG2 in the sera within 14 days following injection of MSP with Quil A or aluminium hydroxide as adjuvants. The persistence of these systemic antibody levels could be maintained through two boosts. Immunisations by the combination of MSP and Quil A achieved a reduction of 25 % in faecal larval shedding, but the number of adult worms and their size was higher compared to that found in the control group. Fecundity of female worms was lower in the group treated with Quil A and MSP. Additional vaccinations of other recombinant proteins together with MSP and Quil A resulted in reduction of larval counts of up to 65 % and reduced worm burdens up to 44 %. Worms isolated from calves of immunized groups showed reduced fecundity and smaller sizes. None of these non-significant results (p>0.05) could be found in groups vaccinated with the same antigens and aluminium hydroxide.   To improve the options for a serological diagnosis of lungworm infections, an ELISA, based on the recombinant MSP-fusionprotein, was established using sera from parasite naïve cattle or from calves experimentally infected with D. viviparus larvae. Specific IgG1 could be detected from day 28 p.i. until day 35 p.i. onwards. In this period detection of experimental infection was possible with a calculated specifity and sensitivity as well as a negative and positive predictive value of 100 %. The transcription of MSP in male worms, as described in other nematodes, was confirmed through quantitative real-time PCR. Investigating first-stage and third-stage larvae, as well as male and female adults of D. viviparus, the MSP-mRNA was detected only in male lungworms. As a result of the immunogenic nature of the procaryoticly expressed MSP-fusionprotein proven in this thesis, the protein appears to be an appropriate vaccine candidate for further investigations and immunisation trials respectively. Additionally, the recombinant fusionprotein exhibits a new possibility to diagnose lungworm infections via ELISA.

Eine röntgenattenuierte Lebendvakzine ist die zurzeit einzige gegen Dictyocaulus viviparus zugelassene Immunisierungsmöglichkeit. Im Rahmen der Erprobung neuer, biotechnologisch synthetisierter Impfstoffe wurden Immunisierungsversuche zur Bestimmung der immunogenen und protektiven Eigenschaften eines rekombinanten Major Sperm Proteins (MSP) von D. viviparus durchgeführt. Darüberhinaus wurde auf Basis dieses Antigens ein ELISA zur Diagnose einer Lungenwurminfektion etabliert und die stadien- und geschlechtsspezifische Transkription des MSP in Lungenwürmern nachgewiesen. Die für das MSP von D. viviparus kodierende cDNA-Sequenz wurde in ein prokaryontisches Vektorsystem kloniert und als GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert. Die anschließende Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie über einen Glutathion-S-Transferase-Tag des rekombinanten Proteins ergab ein Antigen mit einem Reinheitsgehalt von > 93 %. Dieses MSP wurde nach seiner Identifikation über MALDI-TOF in Impfversuchen an Rindern und in ELISAs eingesetzt. Nach Applikation des MSP mit Quil A bzw. Aluminiumhydroxid als Adjuvantien konnte innerhalb von 14 Tagen ein initialer Anstieg von spezifischem IgA, IgM, IgG, IgG1 und IgG2 in Serum der Tiere beobachtet werden. Die Persistenz dieser systemischen Antikörper wurde mit Hilfe zweier Boosterimpfungen bis zum Tag der Sektion aufrechterhalten. Ohne die Verabreichung weiterer Proteine erzielte das MSP in Verbindung mit Quil A eine um 25 % gesenkte Larvenausscheidung bei gestiegener Wurmbürde. Diese Adulten waren zudem größer als die der Kontrollgruppe, wohingegen die Fruchtbarkeit der weiblichen Würmer in der Impfgruppe verringert war. Bei zusätzlicher Injektion anderer rekombinanter Proteine wurde mit Quil A eine Reduktion der ausgeschiedenen Larvenzahl um bis zu 65 % und eine Verringerung der Wurmzahl um bis zu 44 % erreicht. Auch hier konnte eine reduzierte Fruchtbarkeit der weiblichen Lungenwürmer gezeigt werden. Des Weiteren war die Größe der Adulten vermindert. Keines dieser nicht signifikanten Ergebnisse (p>0,05) konnte bei Verwendung der gleichen Antigene in Kombination mit Aluminiumhydroxid gefunden werden. Die serologische Diagnose einer Lungenwurminfektion gelang über die Validierung eines auf dem rekombinanten MSP-Fusionsprotein basierenden ELISA mit den Seren parasitennaiver oder aber experimentell mit D. viviparus infizierter Kälber. Dazu wurden spezifische IgG1 ab dem 28. bis 35. Tag p.i. detektiert. In diesem Zeitraum war der Nachweis der experimentellen Infektion mit einer Spezifität, Sensitivität sowie einem negativen und positiven prediktiven Wert von jeweils rechnerisch 100 % möglich. Mit Hilfe der quantitativen Real-time PCR wurde die bei anderen Nematoden beschriebene ausschließliche Transkription des MSP in männlichen Stadien bestätigt. Innerhalb der untersuchten geschlechtlich undifferenzierten ersten und dritten Larven sowie den männlichen und weiblichen Lungenwürmern wurde die MSP-mRNA nur in den männlichen adulten D. viviparus aufgefunden. Aufgrund der in dieser Arbeit nachgewiesenen immunogenen Eigenschaften des prokaryontisch exprimierten MSP-Fusionsproteins scheint dieses Protein ein geeigneter Vakzinekandidat für weiterführende Untersuchungen bzw. Immunisierungsversuche zu sein. Zusätzlich bietet das rekombinante Fusionsprotein eine neue Möglichkeit, Lungenwurminfektionen mittels eines ELISA zu diagnostizieren.

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Holtum, Christian: Immunreaktion im Kalb auf das rekombinante Major Sperm Protein von Dictyocaulus viviparus als Glutathion-S-Transferase Fusionsprotein. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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