Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Nachweis von Mycoplasma bovis in der Lunge von experimentell infizierten Kälbern mittels in situ-Hybridisierung

Jacobsen, Björn Andreas

Mycoplasma (M.) bovis, beside M. mycoides subsp. mycoides small colony (SC), the agent of contagious bovine pleuropneumonia, is one of the most important pathogens of bovine mycoplasmosis. The disease includes pneumonia and arthritis especially in calves, and mastitis in dairy cows resulting in extensive losses for the cattle industry. Commercial vaccines are presently not available and increasing numbers of M. bovis strains are developing resistance to antibiotics. Knowledge of pathogenesis and persistence of M. bovis especially in the respiratory tract is still insufficient. The aim of this study was to describe the histopathological lesions in lungs of experimentally infected calves and to establish the in situ-hybridization (ISH) method for M. bovis in formalin-fixed and paraffin-embedded lung tissues of these calves. A further aim was to analyse the distribution and localisation of M. bovis-DNA and correlate these findings with immunohistochemical results. Earlier investigations of BUCHENAU (2003) revealed expression of several variable surface proteins (Vsp) of M. bovis in the respiratory tract of experimentally infected calves detected by different monoclonal antibodies. With these antibodies, immunohistochemical staining was also found in alveoli, bronchi and bronchioli, raising the question, if this was due to cross reactions of the antibodies with host structures. The sequence of the gene coding for VspA was used to synthesise two digoxigenin-labelled DNA probes for hybridization of M. bovis-DNA in lung tissue. Formalin-fixed and paraffin-embedded lung samples of five non-infected control calves (group 1) as well as 30 calves originating from different infection experiments (group 2 to group 4) were used. Calves from group 2 euthanised two to ten days post infection showed mild histopathological changes like calves of the control group. M. bovis-DNA was not detectable in any of these animals. Histopathology revealed partly severe lesions with necrosis, suppurative bronchopneumonia, obliterative bronchiolitis and interstitial pneumonia in calves of group 3 and 4 euthanised 21 days post infection with M. bovis. The lesions were consistent with those described in literature. Beside M. bovis, other bacterial agents were detected in lung tissues indicating promotion of secondary bacterial infections due to M. bovis as described in literature. Partly, abundant M. bovis-DNA could be found within necrotic areas and in the exudate of suppurative bronchopneumonia by the in situ-hybridization method established for this investigation. M. bovis-DNA was not detectable in the alveoli, interstitial tissue, peribronchiolar lymphatic tissue and epithelium of the air ways as described by BUCHENAU (2003) with specific antibodies directed against variable surface proteins. The investigation of the lung samples with a commercial monoclonal antibody (MAB970), directed against not defined epitops of M. bovis, revealed M. bovis-antigen in similar areas as M. bovis-DNA detected by ISH. However, positive reactions were found within the epithelium of bronchi and bronchioli also seen in M. bovis negative control animals. These are possibly cross reactions of the antibody with host structures. It can be postulated, that M. bovis persists in the respiratory tract of experimentally infected calves and is possibly excreted with the exudate in cases of suppurative bronchopneumonia. The factors, which enable M. bovis to persist in the lungs of infected cattle, are poorly understood. With the in situ-hybridization another tool was established to investigate, beside vspA, other gene sequences. Further investigations should also include the possible participation of variable surface proteins in the ability of M. bovis to produce biofilms.

Mycoplasma (M.) bovis ist neben M. mycoides subsp. mycoides small colony (SC), dem Erreger der kontagiösen bovinen Pleuropneumonie, einer der bedeutendsten Erreger boviner Mykoplasmosen. Erkrankungen treten hauptsächlich in Form von Pneumonien und Arthritiden speziell bei Kälbern und Mastitiden bei Kühen auf und verursachen weltweit erhebliche wirtschaftliche Verluste. Bislang ist kein wirksamer, kommerziell erhältlicher Impfstoff vorhanden, und es treten zunehmend Resistenzen gegenüber Antibiotika auf. Die Kenntnisse über Pathogenese und Persistenz von M. bovis speziell im Respirationstrakt sind zum Teil noch unzureichend. Ziel dieser Arbeit war es, neben der histopathologischen Beschreibung von Lungenveränderungen bei experimentell infizierten Kälbern die Methode der in situ-Hybridisierung für M. bovis an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Lungengewebe von diesen Kälbern zu etablieren. Dabei sollten die Verteilung und die Lokalisation der DNA analysiert und mit immunhistochemischen Befunden korreliert werden. Frühere Untersuchungen von BUCHENAU (2003) haben gezeigt, dass M. bovis im Respirationstrakt experimentell infizierter Kälber verschiedene variable Oberflächenproteine (engl.: variable surface proteins, Vsps) exprimiert, welche mittels verschiedener monoklonaler Antikörper nachgewiesen werden konnten. Allerdings wurden mit diesen Antikörpern Reaktionsprodukte unter anderem an Alveolen, Bronchiolen und Bronchioli nachgewiesen, wobei es unklar blieb, ob es sich um mögliche Kreuzreaktionen der Antikörper mit wirtseigenen Strukturen handelte. Die Sequenz des Gens, welches für VspA codiert, diente zur Herstellung zweier Digoxigenin markierter DNA-Sonden für die Hybridisierung mit M. bovis-DNA im experimentell infizierten Lungengewebe. Als Material standen Formalin-fixierte und Paraffin-eingebettete Lungengewebeproben von fünf nicht infizierten Kontrollkälbern (Gruppe 1) sowie von 30 Kälbern aus verschiedenen Infektionsversuchen (Gruppe 2 bis 4) zur Verfügung. Die Kälber aus Gruppe 2 wurden innerhalb von zwei bis maximal zehn Tagen nach der Infektion getötet. Histopathologisch wiesen diese wie auch die Kontrollkälber nur geringgradige Veränderungen auf. M. bovis-DNA konnte bei keinem dieser Tiere detektiert werden. Die Kälber aus den Gruppen 3 und 4, die 21 Tage nach einer Infektion mit M. bovis getötet wurden, wiesen zum Teil hochgradige histopathologische Veränderungen in Form von Nekrosen, katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie, obliterierender Bronchiolitis und interstitieller Pneumonie auf. Häufig wurden neben M. bovis noch weitere bakterielle Erreger aus dem Lungengewebe isoliert, so dass eine in der Literatur beschriebene Begünstigung von sekundären bakteriellen Infektionen durch M. bovis nachvollzogen werden konnte. Die Veränderungen entsprachen im Wesentlichen den in der Literatur beschriebenen Läsionen. Innerhalb der Nekrosen und im Exsudat der katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien konnte zum Teil hochgradig M. bovis-DNA mittels der für vorliegende Untersuchung etablierten Methode der in situ-Hybridisierung mit den Sonden VspAI und VspAII nachgewiesen werden. In Alveolen, Interstitien, peribronchiolärem lymphatischen Gewebe und Epithelien konnte keine M. bovis-DNA detektiert werden, wie es von BUCHENAU (2003) mittels spezifisch gegen variable Oberflächenproteine gerichteten Antikörpern beschrieben wurde. Bei einer Untersuchung der Lungenproben mit einem kommerziell erhältlichen, monoklonalen Antikörper (MAB970) konnte in vergleichbaren Arealen wie auch bei der ISH M. bovis-Antigen detektiert werden. Allerdings wurden auch regelmäßig positive Signale im Epithel von Bronchien und Bronchiolen gefunden, die auch bei den M. bovis-negativen Kontrollkälbern auftraten. Hierbei handelte es sich wahrscheinlich um Kreuzreaktionen des Antikörpers mit wirtseigenen Strukturen. Es konnte gezeigt werden, dass M. bovis innerhalb von Nekrosen und im Exsudat katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonien im Respirationstrakt experimentell infizierter Kälber persistiert. Dieses lässt die Vermutung zu, dass M. bovis über das Exsudat bei katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonie mindestens noch 21 Tage ausgeschieden werden kann. Die Faktoren, die eine Persistenz von M. bovis in der Lunge von infizierten Rindern ermöglichen, sind bislang unvollständig geklärt. Mit der in situ-Hybridisierung für M. bovis-DNA wurde ein weiteres Werkzeug etabliert, mit der neben vspA auch weitere Gensequenzen im Lungengewebe des Wirtes untersucht werden können. Künftige Untersuchungen sollten auch die mögliche Beteiligung variabler Oberflächenproteine an der Fähigkeit von M. bovis zur Produktion von Biofilmen berücksichtigen.

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Jacobsen, Björn Andreas: Nachweis von Mycoplasma bovis in der Lunge von experimentell infizierten Kälbern mittels in situ-Hybridisierung. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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