In vitro Untersuchungen über die Beeinflussung des NF[kappa]B-Signaltransduktionsweges nach Infektion von kaninen Keratinozyten und Makrophagen mit Staupe- und Hundeparainfluenzavirus

Ziel der Studie war es, zu untersuchen, ob eine in vitro Infektion kaniner Fußballenkeratinozyten mit den beiden avirulenten Staupevirusstämmen R252-CDV und Ond- CDV in den Keratinozytenkulturen zu ähnlichen Veränderungen der Proliferation und des Gehaltes der Proteine des NFκB-Signaltransduktionsweges der Keratinozyten führt, wie sie für Keratinozyten bei der Hartballenkrankheit vorzufinden sind. Die Untersuchungen wurden mit kaninen Fußballenkeratinozytenkulturen, welche mit R252-CDV und Ond-CDV infiziert wurden, durchgeführt. Die infizierten Kulturen wurden jeweils mit nicht-infizierten Kulturen verglichen. Um zu bestimmen, inwieweit Veränderungen virus- oder zelltypspezifisch waren, fand zusätzlich eine Infektion der Keratinozytenkulturen mit dem kaninen Parainfluenzavirus (CPIV) und eine vergleichende Untersuchung von persistierend mit Ond-CDV infizierten und nicht-inifzierten DH82-Zellkulturen (Makrophagen) statt. Eine erfoglreiche Infektion der Zellen wurde durch den Nachweis des Nukleokapsid- Proteins der Staupeviren beziehungsweise des Nukleokapsid-Proteins-C des CPIV mittels Immunzytochemie und Westernblot-Analyse gezeigt. Zudem traten in den infizierten Kulturen morphologische Veränderungen der Zellen auf, die in den nichtinfizierten Kulturen nicht vorhanden waren. Bei den mit R252-CDV, Ond-CDV und CPIV infizierten Keratinozyten wurde mittels Immunzytochemie der prozentuale Anteil der infizierten Zellen bezogen auf die Gesamtheit aller Zellen am Tag 3, 5 und 7 p.i. bestimmt. In persistierend mit Ond-CDV inifzierten DH82-Zellkulturen sind üblicherweise zu jedem Zeitpunkt 80% bis 100% der Zellen infiziert (Puff et al., 2006; eingereicht bei Exp. Cell Res.). Die Proliferationsrate wurde anhand folgender Methodik untersucht. Erstens wurde die Zellzahl am Tag 3, 5 und 7 p.i. bestimmt. Dies erfolgte, indem an diesen Zeitpunkten die Zellzahl pro mm2 Objektträgerfläche ermittelt wurde. Zweitens fand an diesen Untersuchungstagen ein Auszählen der Mitoserate statt. Drittens wurde an diesen Untersuchungszeitpunkten der prozentuale Anteil der Zellen, die nach 24- stündiger Inkubation mit BrdU dieses inkorporiert hatten, zur Gesamtzahl der Zellen untersucht. Zur Bestimmung des Gehaltes der Proteine des NFκB-Signaltransduktionsweges fand bei den infizierten und nicht-infizierten Kulturen am Tag 7 p.i. eine Proteinextraktion statt. Sowohl im nukleären als auch im zytoplasmatischen Extrakt wurde nach Auftrennung der Proteine mittels SDS-PAGE der Gehalt von p65 mittels Westernblot-Analyse bestimmt. Zur Messung des Gehaltes von IκBα diente das gesamte Zelll sat. Bei den mit R252-CDV und Ond-CDV infizierten Keratinozytenkulturen war im Vergleich zu den nicht-infizierten Kulturen die Zellzahl sowie die Mitose- und BrdUInkorporationsrate an allen Untersuchungszeitpunkten geringer als bei den nichtinfizierten Kulturen. Zugleich besaßen die mit R252-CDV und Ond-CDV infizierten Kulturen deutlich mehr nukleäres p65 und weniger IκBα als die Kontrollkulturen. Der Gehalt von zytoplasmatischem p65 war im Vergleich zu den nicht-infizierten Kulturen bei den infizierten Kulturen erhöht. Bei den mit CPIV infizierten Keratinozytenkulturen war die Proliferation nur während der Anfangsphase der Infektion gegenüber der der nicht-infizierten Kulturen eindeutig vermindert. So wiesen sie an allen Untersuchungszeitpunkten im Vergleich zu den nicht-infizierten Kulturen eine geringere Zellzahl und BrdU-Inkorporationsrate auf. Die Mitoserate war anfangs geringer, am Ende des Untersuchungszeitraumes jedoch höher als bei den nicht-infizierten Zellen. Der Gehalt von nukleärem p65 war bei den mit CPIV infizierten Keratinoyztenkulturen deutlich höher als bei den Kontrollkulturen. Sie wiesen jedoch nur unbedeutend weniger IκBα und zudem weniger zytoplasmatisches p65 als die nicht-infizierten Kulturen auf Die Proliferationsrate der persistierend mit Ond-CDV infizierten DH82-Zellkulturen war gegenüber der der nicht-infizierten Kulturen nicht eindeutig in die eine oder andere Richtung verändert. Die mit Ond-CDV infizierten DH82-Zellkulturen besaßen ebenso wie die mit R252-CDV und Ond-CDV infizierten Keratinozyten mehr nukleäres und zytoplasmatisches p65 sowie weniger IκBα als die nicht-infizierten Kulturen. Eine Infektion kaniner Keratinozytenkulturen mit R252-CDV und Ond-CDV führte zu morphologischen Veränderungen der Zellen, die sich von denen unterschieden, die nach Infektion der Keratinozytenkulturen mit CPIV auftraten. Nach Infektion der kaninen Keratinozyten mit R252-CDV und Ond-CDV kam es im Vergleich zu den Kontrollkulturen zu einer Hemmung der Proliferation. Diese erfolgte auf eine andere Art und Weise als nach Infektion der Keratinozytenkulturen mit CPIV. Es fand nur in den infizierten Keratinozytenkulturen, nicht aber in den DH82- Zellkulturen eine Proliferationshemmung statt. In allen infizierten Kulturen unabhängig vom Zelltyp und Virusstamm stieg im Vergleich zu den nicht-infizierten Kulturen der Gehalt von nukleärem p65. Es kann vermutet werden, dass sowohl in den Keratinozyten- als auch in den Makrophagenkulturen, die mit avirulentem Staupevirus infiziert waren, eine Beeinflussung des NFκB-Signaltransduktionsweges dahingehend stattfand, dass IκBα vermehrt abgebaut wurde und NFκB im gesteigerten Maße in den Zellkern translozierte. Bei den mit CPIV infizierten Kulturen kam es dagegen nur zu einer sehr geringfügigen Abnahme des Gehaltes von IκBα. Demnach scheint der erhöhte Gehalt von nukleärem p65 in den mit CPIV infizierten Kulturen auf einem anderen Mechanismus zu beruhen als bei den mit R252-CDV und Ond-CDV infizierten Kulturen.