Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In vitro Untersuchungen über die Beeinflussung des NF[kappa]B-Signaltransduktionsweges nach Infektion von kaninen Keratinozyten und Makrophagen mit Staupe- und Hundeparainfluenzavirus

Köchling, Magdala Maria

Aim of the study was to investigate whether the in vitro infection of canine footpad keratinocytes (CFK) with the two avirulent CDV-strains R252-CDV and Ond-CDV would modify the proliferation and steady state levels of proteins of the NFκBpathway in keratinocyte cultures in a similar manner as was seen in keratinocytes from dogs with hard pad disease. The experiments were performed using CFK, which were infected with R252-CDV and Ond-CDV. The infected cultures were compared to non-infected cultures. To investigate whether changes were virus- and cell type-specific keratinocyte cultures were also infected with canine parainfluenza virus (CPIV). Additionally, a comparison between non-infected DH82-cell cultures (macrophages) and DH82-cell cultures persistently infected with Ond-CDV was performed. Presence of the N-protein of CDV or rather the N-protein-C of CPIV was assessed using immunocytochemistry and western blot analysis. It was shown that cells were infected successfully. Furthermore, cells in infected cultures showed morphological changes, which were not present in non-infected cultures. The percentage of the cells infected with R252-CDV, Ond-CDV and CPIV was determinded using immunocytochemistry at day 3, 5 and 7 p.i. 80% to 100% of the cells are usually infected in DH82-cell cultures persistently infected with Ond-CDV at any timepoints (Puff et al., 2006; paper in submission). The proliferation indices were investigated using the following methods. Firstly, absolute cell numbers were counted at day 3, 5 and 7 p.i. Cells were grown on glass slides and the cell number per mm2 was counted. Secondly, the percentage of mitotic cells was determined at this timepoints. Thirdly, the percentage of cells, which had BrdU incorporated after incubation with BrdU for 24 hours, was analysed at this timepoints. To investigate the steady state levels of proteins of the NFκB-pathway proteins were extracted at day 7 p.i. Proteins were separated using SDS-PAGE. Steady state levels of nuclear and cytoplasmatic p65 as well as IκBα was analysed by western blot analysis. R252-CDV and Ond-CDV infected keratinocyte cultures had lower absolute cell numbers and lower numbers of cells with mitotic figures and of cells positive for BrdU compared to controls at all timepoints. R252-CDV and Ond-CDV infection resulted in increased expression of steady state level of nuclear and cytoplasmatic p65 and in decreased expression of steady state level of IκBα compared to control culturs. In CPIV infected keratinocyte cultures the proliferation was only lower compared to controlls at the early timepoints of infection. CPIV infected cultures had lower absolute cell numbers and fewer cells, which had BrdU incorporated, than noninfected cultures at all timepoints. Compared to controls the number of mitotic cells were decreased at early timepoints and increased at the end of the infection. CPIV infected cultures had a higher steady state level of nuclear p65 and a nearly equal steady state level of IκBα compared to controls. The steady state level of cytoplasmatic p65 was decreased in infected cultures compared to controls. DH82-cell cultures persistently infected with Ond-CDV did not show a clear increase or decrease of proliferation compared to non-infected DH82-cell cultures. In persistent infected DH82-cell cultures the steady state level of nuclear and cytoplasmatic p65 was higher compared to controls. DH82-cell cultures persistently infected with Ond-CDV did not show a clear increase or decrease of proliferation compared to non-infected DH82-cell cultures. In persistent infected DH82-cell cultures the steady state level of nuclear and cytoplasmatic p65 was higher compared to controls. DH82-cell cultures persistently infected with Ond-CDV had less IκBα than non-infected cultures. Cells of keratinocyte cultures infected with R252-CDV and Ond-CDV showed morphological changes, which differ from the changes seen in keratinocyte cultures infected with CPIV. R252-CDV and Ond-CDV infected cultures had lower proliferation indices compared to controls. The proliferation decreased in R252-CDV and Ond-CDV infected cultures in a different manner as in CPIV infected cultures. The proliferation did only decreased in the infected keratinocyte cultures but not in the infected DH82-cell cultures. All infected cultures had higher steady state levels of nuclear p65 compared to controls. It seems that in keratinocyte cultures and macrophage cultures infected with a virulent CDV-strain an increased degradation of the inhibitor IκBα in the cytoplasm occurred. By this more p65 translocated into the nucleus. In CPIV infected keratinocyte cultures the steady state level of IκBα was nearly equal compared to controls. Therefore in CPIV infected cultures the higher steady state level of nuclear p65 seems to be caused in a different manner than in keratinocyte cultures infected with R252-CDV and Ond-CDV.

Ziel der Studie war es, zu untersuchen, ob eine in vitro Infektion kaniner Fußballenkeratinozyten mit den beiden avirulenten Staupevirusstämmen R252-CDV und Ond- CDV in den Keratinozytenkulturen zu ähnlichen Veränderungen der Proliferation und des Gehaltes der Proteine des NFκB-Signaltransduktionsweges der Keratinozyten führt, wie sie für Keratinozyten bei der Hartballenkrankheit vorzufinden sind. Die Untersuchungen wurden mit kaninen Fußballenkeratinozytenkulturen, welche mit R252-CDV und Ond-CDV infiziert wurden, durchgeführt. Die infizierten Kulturen wurden jeweils mit nicht-infizierten Kulturen verglichen. Um zu bestimmen, inwieweit Veränderungen virus- oder zelltypspezifisch waren, fand zusätzlich eine Infektion der Keratinozytenkulturen mit dem kaninen Parainfluenzavirus (CPIV) und eine vergleichende Untersuchung von persistierend mit Ond-CDV infizierten und nicht-inifzierten DH82-Zellkulturen (Makrophagen) statt. Eine erfoglreiche Infektion der Zellen wurde durch den Nachweis des Nukleokapsid- Proteins der Staupeviren beziehungsweise des Nukleokapsid-Proteins-C des CPIV mittels Immunzytochemie und Westernblot-Analyse gezeigt. Zudem traten in den infizierten Kulturen morphologische Veränderungen der Zellen auf, die in den nichtinfizierten Kulturen nicht vorhanden waren. Bei den mit R252-CDV, Ond-CDV und CPIV infizierten Keratinozyten wurde mittels Immunzytochemie der prozentuale Anteil der infizierten Zellen bezogen auf die Gesamtheit aller Zellen am Tag 3, 5 und 7 p.i. bestimmt. In persistierend mit Ond-CDV inifzierten DH82-Zellkulturen sind üblicherweise zu jedem Zeitpunkt 80% bis 100% der Zellen infiziert (Puff et al., 2006; eingereicht bei Exp. Cell Res.). Die Proliferationsrate wurde anhand folgender Methodik untersucht. Erstens wurde die Zellzahl am Tag 3, 5 und 7 p.i. bestimmt. Dies erfolgte, indem an diesen Zeitpunkten die Zellzahl pro mm2 Objektträgerfläche ermittelt wurde. Zweitens fand an diesen Untersuchungstagen ein Auszählen der Mitoserate statt. Drittens wurde an diesen Untersuchungszeitpunkten der prozentuale Anteil der Zellen, die nach 24- stündiger Inkubation mit BrdU dieses inkorporiert hatten, zur Gesamtzahl der Zellen untersucht. Zur Bestimmung des Gehaltes der Proteine des NFκB-Signaltransduktionsweges fand bei den infizierten und nicht-infizierten Kulturen am Tag 7 p.i. eine Proteinextraktion statt. Sowohl im nukleären als auch im zytoplasmatischen Extrakt wurde nach Auftrennung der Proteine mittels SDS-PAGE der Gehalt von p65 mittels Westernblot-Analyse bestimmt. Zur Messung des Gehaltes von IκBα diente das gesamte Zelll sat. Bei den mit R252-CDV und Ond-CDV infizierten Keratinozytenkulturen war im Vergleich zu den nicht-infizierten Kulturen die Zellzahl sowie die Mitose- und BrdUInkorporationsrate an allen Untersuchungszeitpunkten geringer als bei den nichtinfizierten Kulturen. Zugleich besaßen die mit R252-CDV und Ond-CDV infizierten Kulturen deutlich mehr nukleäres p65 und weniger IκBα als die Kontrollkulturen. Der Gehalt von zytoplasmatischem p65 war im Vergleich zu den nicht-infizierten Kulturen bei den infizierten Kulturen erhöht. Bei den mit CPIV infizierten Keratinozytenkulturen war die Proliferation nur während der Anfangsphase der Infektion gegenüber der der nicht-infizierten Kulturen eindeutig vermindert. So wiesen sie an allen Untersuchungszeitpunkten im Vergleich zu den nicht-infizierten Kulturen eine geringere Zellzahl und BrdU-Inkorporationsrate auf. Die Mitoserate war anfangs geringer, am Ende des Untersuchungszeitraumes jedoch höher als bei den nicht-infizierten Zellen. Der Gehalt von nukleärem p65 war bei den mit CPIV infizierten Keratinoyztenkulturen deutlich höher als bei den Kontrollkulturen. Sie wiesen jedoch nur unbedeutend weniger IκBα und zudem weniger zytoplasmatisches p65 als die nicht-infizierten Kulturen auf Die Proliferationsrate der persistierend mit Ond-CDV infizierten DH82-Zellkulturen war gegenüber der der nicht-infizierten Kulturen nicht eindeutig in die eine oder andere Richtung verändert. Die mit Ond-CDV infizierten DH82-Zellkulturen besaßen ebenso wie die mit R252-CDV und Ond-CDV infizierten Keratinozyten mehr nukleäres und zytoplasmatisches p65 sowie weniger IκBα als die nicht-infizierten Kulturen. Eine Infektion kaniner Keratinozytenkulturen mit R252-CDV und Ond-CDV führte zu morphologischen Veränderungen der Zellen, die sich von denen unterschieden, die nach Infektion der Keratinozytenkulturen mit CPIV auftraten. Nach Infektion der kaninen Keratinozyten mit R252-CDV und Ond-CDV kam es im Vergleich zu den Kontrollkulturen zu einer Hemmung der Proliferation. Diese erfolgte auf eine andere Art und Weise als nach Infektion der Keratinozytenkulturen mit CPIV. Es fand nur in den infizierten Keratinozytenkulturen, nicht aber in den DH82- Zellkulturen eine Proliferationshemmung statt. In allen infizierten Kulturen unabhängig vom Zelltyp und Virusstamm stieg im Vergleich zu den nicht-infizierten Kulturen der Gehalt von nukleärem p65. Es kann vermutet werden, dass sowohl in den Keratinozyten- als auch in den Makrophagenkulturen, die mit avirulentem Staupevirus infiziert waren, eine Beeinflussung des NFκB-Signaltransduktionsweges dahingehend stattfand, dass IκBα vermehrt abgebaut wurde und NFκB im gesteigerten Maße in den Zellkern translozierte. Bei den mit CPIV infizierten Kulturen kam es dagegen nur zu einer sehr geringfügigen Abnahme des Gehaltes von IκBα. Demnach scheint der erhöhte Gehalt von nukleärem p65 in den mit CPIV infizierten Kulturen auf einem anderen Mechanismus zu beruhen als bei den mit R252-CDV und Ond-CDV infizierten Kulturen.

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Köchling, Magdala Maria: In vitro Untersuchungen über die Beeinflussung des NF[kappa]B-Signaltransduktionsweges nach Infektion von kaninen Keratinozyten und Makrophagen mit Staupe- und Hundeparainfluenzavirus. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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