Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Der Einfluss der in vitro Kultur boviner Embryonen auf die Struktur der extraembryonalen Matrix (Zona pellucida)

Mertens, Eva-Maria

Significant lower pregnancy rates after transfer of in vitro produced embryos may, besides an influence of in vitro culture on the embryo proper, also indicate an influence on the oocyte and embryo surrounding coats, the zona pellucida (ZP) or embryonic coats (EC). The ZP/EC has in addition to its fundamental significance for a successful fertilisation also important functions for early embryonic development. To determine the influence of the in vitro culture on the structure of the ZP/EC, a comparative investigation of immature, in vivo and in vitro matured oocytes and identically produced embryos (zygotes, 2- / 4 -, 8- / 16- cells, morula, blastocysts) was carried out. The reticular, spongy part of the ZP/EC and the thickness of the ZP/EC were determined via lightmicroscopic investigation. By scanning-electronic microscopy the surface structure, the number and the area of the pores of the samples were compared. The surface of the immature and in vivo matured oocytes showed well-developed, spherical granules and a very large number of pores, whereas the majority of the samples of in vitro matured oocytes had spherical and flattened granules and a poreless surface structure. The rest of the in vitro matured oocytes showed the same surface structure as immature and in vivo matured oocytes. In the embryonic stages, the reticular part of the EC was larger for all in vivo stages than for the equivalent in vitro stages, which indicates a condensation of the EC of the in vitro embryos. 100% of the in vivo stages showed a EC surface with spherical granules. 100% of the in vivo zygotes and the 2- / 4- cells had a very large number of pores, whereas a great part of the in vivo morulae (61,5%) and blastocysts (33,3%) showed a poreless structure and the remaining part showed a small number of pores. 100% of the in vitro embryos showed only flattened granules, which may be a result of a retarded development or a degeneration of the surface under in vitro conditions. The zygotes make an exception, the majority of the samples had flattened and spherical granules. 100% of the in vitro embryos had a porous surface structure with a very large number of pores, whereas the major part (55,8%) of the in vitro morulae and blastocysts had a large number of pores. Only in vitro embryos showed signs of degradation. The thickness of the EC was significantly lower for the in vitro morulae and the blastocysts than for the equivalent in vivo stages. The thickness of the EC increased for the in vivo morulae in comparison to the 8- / 16- cells for about 30%. This thickening might be caused by maternal factors and takes place without a change of the reticular structure. The area of the pores variated extremely (between 6,37 and 2508,19nm2) on the surface structure of the samples, however there was no correlation between the stage of development or in vivo/vitro production. According to that an important influence of the in vitro maturation and culture on the structure of the ZP/EC takes place. These structural changes may be a sign of a retarded development or a degeneration under in vitro conditions, and may, according to the functions of the ZP/EC mentioned above, have negative effects on a successful fertilisation of the oocyte and the early embryonic development. No change of the structure of the ZP/EC after a successful fertilisation could be observed. The assessment of VANROOSE et al. (2000), that BHV-1 and BVDV cannot be transmitted by the embryo transfer of in vitro produced embryos, cannot necessarily be transferred to the transfer of in vivo embryos, because of the important differences in the ZP/EC structure of in vivo and in vitro produced embryos and should, because of its important practical relevance, be verified with in vivo embryos. Furthermore it could be determined by this investigation, that in cattle, as described for many other species, a physiological modification of the EC structure during the early embryonic development takes place. These structural developments might be influenced or affected by maternal factors, because they could not be assessed in in vitro produced embryos. Whether these structural dynamics may be due to oviductal or uterine secretions or if also maternal mediators may cause these structural modifications in embryos need to be investigated in further studies.

Die signifikant niedrigeren Trächtigkeitsraten nach Embryonentransfer in vitro produzierter Embryonen lassen neben einem Einfluss der in vitro Kultur auf den Embryo selbst auch eine Beeinflussung der die Eizelle und den Embryo umgebenden Hülle, der Zona pellucida (ZP) bzw. der extraembryonalen Matrix (EEM), vermuten. Die ZP/EEM hat neben ihrer fundamentalen Bedeutung für eine erfolgreiche Fertilisation auch wichtige Funktionen bei der frühen Embryonalentwicklung. Zur Untersuchung des Einfluss der in vitro Kultur auf die Struktur der ZP/EEM wurde eine vergleichende Untersuchung der ZP/EEM von un-reifen, in vivo und in vitro gereiften Eizellen und ebenso produzierten Embryonen (Zygote, 2- / 4-, 8- / 16- Zeller, Morula, Blastozyste) durchgeführt. Durch eine lichtmikroskopische Untersuchung der Proben wurde der retikuläre, lockere Anteil an der ZP/EEM und die Breite der ZP/EEM bestimmt. Rasterelektronenmikroskopisch konnte die Oberflächen-struktur, die Anzahl und die Fläche der Poren bei den Proben verglichen werden. Die Oberfläche der unreifen und der in vivo gereiften Eizellen zeigte gut ausgebildete, kugelige Granula und eine sehr große Anzahl an Poren, wohingegen bei den in vitro gereiften Eizellen der überwiegende Teil der Proben (68,8%) kugelige und flache Granula und eine porenlose Struktur zeigte. Die restlichen in vitro gereiften Eizellen zeigten die gleiche Oberflächenstruktur wie die unreifen und in vivo gereiften Eizellen. Bei den Embryonal-stadien war der retikuläre Anteil der EEM bei allen in vivo Stadien größer als bei den entsprechenden in vitro Stadien, was eine Verdichtung der EEM der in vitro Embryonen anzeigt. Die Oberfläche der EEM zeigte bei den in vivo Stadien zu 100% kugelige Granula. 100 % der in vivo Zygoten und 2- / 4- Zeller hatten eine sehr große Anzahl an Poren, wohingegen ein großer Anteil der in vivo Morulae (61,5%) und Blastozysten (33,3%) eine porenlose Struktur und der übrige Anteil eine geringe Anzahl an Poren zeigte. Die Oberfläche der in vitro Embryonalstadien zeigte zu 100% nur flache Granula, dies kann Folge einer retardierten Entwicklung oder einer Degeneration der Oberfläche unter in vitro Bedingungen sein. Eine Ausnahme bildeten die Zygoten, wo der überwiegen-de Anteil der Proben flache und kugelige Granula hatte. 100% der in vitro Embryonen hatten eine poröse Oberfläche mit einer sehr großen Anzahl an Poren, wobei der über-wiegende Anteil (55,8%) der in vitro Morulae und Blastozysten eine große Anzahl an Poren hatte. Eine degradiert erscheinende Oberfläche kam nur bei in vitro Embryonen vor. Die Breite der EEM war bei den in vitro Morulae und Blastozysten signifikant niedriger als bei den entsprechenden in vivo Embryonalstadien. Die Breite der EEM nahm bei den in vivo Morulae im Vergleich zu den in vivo 8- / 16- Zellern um cirka 30% zu. Diese Breitenzunahme muss durch maternale Fak-toren bedingt sein und findet ohne eine Ver-legung der retikulären Struktur statt. Die Fläche der Poren variierte erheblich (zwischen 6,37 und 2508,19 nm2) auf den Probenoberflächen, wobei keine Korrelation zum Entwicklungsstadium oder in vivo/vitro Produktion vorlag. Generell gesehen findet eine er-hebliche Beeinflussung der Struktur der ZP/EEM durch die in vitro Reifung und Kultur statt. Diese Strukturveränderungen können entweder Anzeichen einer retardierten Entwicklung oder einer Degeneration unter in vitro Bedingungen sein, und können hinsichtlich der oben genannten Funktionen der ZP/EEM eine negative Auswirkung auf eine erfolgreiche Befruchtung der Eizelle und die frühembryonale Entwicklung haben. Es konnte keine Strukturveränderung der ZP/EEM durch erfolgte Befruchtung beobachtet werden. Die Feststellung von VANROOSE et al. (2000), dass BHV-1 und BVDV beim Embryonen-transfer in vitro produzierter Embryonen nicht übertragbar ist, lässt sich auf Grund der erheblichen Unterschiede in der Struktur der ZP/EEM von in vivo und in vitro produzierten Embryonen nicht unbedingt auf den Transfer von in vivo Embryonen übertragen und sollte hinsichtlich der erheblichen Praxisrelevanz an in vivo Embryonen überprüft werden. Weiterhin konnte durch diese Arbeit festgestellt werden, dass beim Rind, wie schon bei vielen anderen Tierarten beschrieben, auch eine Strukturveränderung der EEM während der frühen Embryonalentwicklung in vivo stattfindet. Diese strukturellen Entwicklungen müssen durch maternale Faktoren beeinflusst oder hervorgerufen werden, da sie bei den in vitro produzierten Embryonen nicht darzustellen waren. Ob es sich bei diesen Struktur-veränderungen um Sekrete aus Ovidukt und Uterus handelt, oder ob auch maternale Botenstoffe, den Embryo zu dieser Veränderung der EEM veranlassen, ist in weiter-gehenden Studien zu untersuchen.

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Mertens, Eva-Maria: Der Einfluss der in vitro Kultur boviner Embryonen auf die Struktur der extraembryonalen Matrix (Zona pellucida). Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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