Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung flüssigkonservierten Eberspermas mittels computergestützter Spermienanalyse und Bindung FITC-konjugierter Mannose an die Spermienmembran

Nicolae, Markus

Changes in stored liquid-preserved boar semen often can not satisfactorily be seen during the first days of storage by means of classical spermatological tests. This study was accomplished to test if these changes could be identified by computer-assisted semen analysing (CASA) methods. Special emphasis was put on computer-assisted motility analyses and an assay testing the ability of the sperm plasma membrane to bind Mannose. First step was to define directives for standardisation concerning sample preparation and measurement for CASA with Minitüb`s (Tiefenbach, Germany) SpermVisionTM system (Ver­sion 2004) using measurement chambers from Leja (Nieuw-Vennep, the Nederlands). The SpermVisionTM system analyses simultaneously motility and concentration of semen samples. The influence of sperm concentration, of the time between filling of the chamber and starting the measurements, of the duration of the analysis, selection of and number of measuring positions in the chamber, of the extender and of ejaculate characteristics as agglutinations and non sperm particles were examined. To verify the resulting recommendations, concentration and motility were analysed in split-sample assays comparing results with classical as well as modern methods. These tests demonstrated a high reproducibility and precision of SpermVisionTM results if the directives for measurement elaborated in this work are followed. Further analyses examining changes during storage of liquid-preserved boar semen regarding motility analysed by CASA and membrane integrity by flow cytometry were performed. Semen samples from 34 boars from two boar stations where analysed from day 2 to 13 of storage. Samples that displayed more 70 % or more estimated motility on day 9 of storage showed no significant changes in computer-assisted measured percent motility. Sperm from these samples had significantly increased values of distance and velocity parameters (distance averaged path DAP, velocity averaged path VAP, etc.) and of the amplitude of head movement (ALH). In the same time linearity and straightness (LIN, STR) decreased significantly as well as flow cytometrically assessed membrane and acrosome integrity values. A second experiment was performed to test changes in Mannose-binding ability of boar sperm plasma membrane during storage. FITC-conjugated Mannose was incubated with boar semen and the quality as well as the quantity of fluorescence binding to sperm membranes were analysed by means of flow cytometry. Successively, the Mannose concentration and the incubation time were varied, a competitive blocking of the binding was attempted and the behaviour of Galactose and Glucitol displacing the Mannose were compared to each other and to Mannose under capacitating conditions. By means of flow cytometry and fluorescence microscopy, no specific binding of Mannose-PAA-FITC and Mannose-BSA-FITC to intact boar sperms could be demonstrated. The fluorescence-marked monosaccharides were connected most to swollen, agglutinated and acrosome-reacted sperm heads. In conclusion, in the current work flow cytometric analyses of Mannose binding to the sperm plasma membrane were not appropriate to demonstrate the influence of storage on liquid-preserved boar semen. Even total and progressive motility of sperm samples measured by SpermVisionTM were not sensitive enough. In contrast to that, parameters describing single sperm moving patterns seemed to have the potential of detecting capacitation like changes in liquid-preserved boar semen.

Veränderungen an flüssigkonserviertem Ebersperma während der ersten Tage der Lagerung können mit standardspermatologischen Untersuchungen nicht zufriedenstellend erkannt wer­den. In der vorliegenden Arbeit sollte geprüft werden, ob lagerungsbedingte Veränderungen mit Hilfe von computergestützten Analyseverfahren erfassbar sind. Im Besonderen sollte an flüssigkonserviertem Ebersperma die Motilität computergestützt und die Mannosebindungs­fähigkeit der Spermienmembran flowzytometrisch untersucht werden. Für den ersten Teil waren zunächst Richtlinien für die Standardisierung der computergestütz­ten Spermiena­nalyse mit dem SpermVi­sionTM-System (Version 2004) der Firma Minitüb (Tie­fenbach, Deutsch­land) in der Messkammer der Firma Leja (Nieuw-Vennep, Holland) hin­sichtlich Probenvorbereitung und Messung festzulegen. Das SpermVi­sionTM-System analy­siert zugleich Motilität und Konzentration von Samenproben. Es wurde der Einfluss der Kon­zentration, des Zeitintervalls zwischen Kammerfüllung und Messbeginn, der Messdauer, der Auswahl der Messfelder, des Verdünners und der Ejakulatsbeschaffenheit (Agglutinationen, Fremdbeimengungen) auf die Konzentrations- und Motilitätsmessung untersucht. Zur Prüfung der resultierenden Empfehlungen wurde in split-sample-Versuchen Konzentration und Moti­lität zusätzlich mit klassischen und mit modernen Methoden bestimmt und die Ergebnisse verglichen. Diese Untersuchungen attestierten dem SpermVi­sionTM-System, bei exakter Ein­haltung der Messempfehlungen, sowohl eine gute Wiederholbarkeit als auch eine hohe Ge­nauigkeit. Desweiteren sollten lagerungsbedingte Veränderungen von flüssigkonserviertem Ebersperma hinsichtlich computergestützt ermittelter Motilitätsparameter und Membranstatus untersucht werden. Dazu wurden Samenproben von 34 Ebern aus zwei Stationen vom 2. bis zum 13. Lagerungstag untersucht. Die Proben, die noch am 9. Lagerungstag mehr als 70 % subjektive Motilität aufwiesen, zeigten bis zum 9. Lagerungstag keine signifikanten Veränderungen der computergestützt ermittelten prozentualen Motilitätsparameter. Die motilen Spermien aus diesen Proben hingegen zeigten signifikante Zunahmen der absoluten Strecken- und Ge­schwindigkeitswerte (Strecke der mittleren Bahn DAP, Geschwindigkeit auf der mittleren Bahn VAP, etc.) sowie der Amplitude des Kopfausschlages (ALH) in diesem Zeitraum. Die Parameter, welche den Gradeauslauf der Spermienbewegung beschreiben (Linearität LIN, Geradlinigkeit STR), nahmen jedoch signi­fikant ab. Weiterhin zeigten die mittels Flowzyto­meter bestimmten Membran- und Akro­somintegritätsparameter im gleichen Zeitraum eine signifikante Verminderung der Werte. Im zweiten Teil war zu prüfen, inwieweit sich die Mannosebindungsfähigkeit der Ebersper­mien während der Lagerung verändert. Dazu wurde FITC-gekoppelte Mannose mit Eberspermien inkubiert und es wurde versucht die Qualität- und Quantität der Bindung flow­zytometrisch zu charakterisieren. Hierfür wurde die Konzentration der Mannose sowie die Inkubationszeiten variiert, die Bindung versucht kompetitiv zu hemmen und das Bindungs­verhalten von Galaktose und Glucitol vergleichend zu Mannose, bei Inkubation unter Kapa­zitationsbedingungen, verglichen. Durch flowzytometrische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnte eine spezifische Bindung von Mannose-PAA-FITC und Mannose-BSA-FITC an intakte Eberspermien jedoch nicht nachgewiesen werden. Die fluoreszenzmar­kierten Zucker banden vor allem an geschwollene, agglutinierte und akrosomreagierte Sper­mienköpfe. Schlussfolgernd ist festzustellen, dass in der vorliegenden Arbeit die flowzytometrische Analyse der Mannosebindung an die Spermienplasmamembran nicht geeignet war, um den Lagerungseinfluss auf flüssigkonserviertes Ebersperma sichtbar zu machen. Auch die mit SpermVisionTM erhobenen Motilitätsparameter Gesamt- und progressive Motilität waren nicht ausreichend sensitiv. Parameter, die Spermienbewegungsmuster charakterisieren, schienen hingegen das Potential zu haben, kapazitationsähnliche Veränderungen an flüssigkonservier­tem Ebersperma darzustellen

Zitieren

Zitierform:

Nicolae, Markus: Untersuchung flüssigkonservierten Eberspermas mittels computergestützter Spermienanalyse und Bindung FITC-konjugierter Mannose an die Spermienmembran. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export