Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Matrix-Metalloproteinasen und ihre Inhibitoren bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis des Hundes

Puff, Christina

In the literature section a short overview about the classification of morbilliviruses, their hosts and the pathogenesis of canine distemper virus (CDV) infection is given. Additionally, a short summary of the pathogenesis of canine demyelinating distemper encephalitis is provided. Another part deals with paramyxoviruses as oncolytic viruses. Furthermore, classification, structure, activation, regulation and substrates of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors are detailed. In addition, the characteristics and functions of the reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs (RECK) as an inhibitor of MMPs are elucidated.   In a pilot study, non infected and persistently CDV infected DH82 cells were compared concerning their MMP-mRNA expression pattern using reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The genes investigated could be divided according to their mRNA-expression profile in three groups. There are genes with a significant down- (MMP-2, TIMP-1, TIMP-2) or up-regulation (MMP-13, MMP-14, RECK) and with no significant changes (MMP-9) in the persistently CDV-infected DH82 cells. GAPDH mRNA was detected in all samples, CDV mRNA only in persistently CDV-infected DH82 cells.   Summarized, the persistently CDV-infected DH82 cells showed a marked down-regulation of the MMP-2 mRNA expression and, simultaneously, an up-regulation of the RECK-mRNA expression. This might indicate a virally induced inhibition of the proteolytic capacity of DH82 cells due to the up-regulation of RECK. This effect may lead to a reduced invasive potential of tumor cells. Contrary, an up-regulation of  the mRNA expression of MMP-13 and MMP-14 was found. Possibly, this contributes to a proteolytic cascade with an increase of the invasive properties of DH82 cells.    In the second part of the study, the cerebella of 34 dogs, 26 of the animals infected with CDV and 8 healthy control dogs, were investigated. Histochemical and immunohistological investigations as well as mRNA-isolation were performed, using O.C.T. embedded cerebella. A hematoxylin – eosin and luxol fast blue kresyl echt violet stain, for determination of the degree of demyelination, have been used. Immunohistologically, CDV-nucleoprotein-antigen was detected. Antibodies specific for astrocytes (GFAP) and lymphocytes (CD3, CD21) were used for phenotyping of the involved cells. Microglia and macrophages were marked with the lectin BS-1. The mRNA expression of MMP-2, -9, -12, -13, -14, TIMP-1, -2, RECK, CDV and GAPDH were investigated using RT-qPCR.   The healthy control animals and the CDV infected dogs were classified into 4 groups on the basis of the histopathologigal investigations and the detection of CDV nucleoprotein. Group 1 consisted of the healthy animals, group 2 of the dogs with acute lesions, group 3 of the animals with subacute, demyelinating plaques without inflammation and group 4 of the dogs with inflammatory, demyelinating lesions.   CDV nucleoprotein antigen could be demonstrated in all CDV infected animals with varying quantity and intensity. CDV mRNA was detectable in all infected dogs. GFAP positive cells were found in all groups with a significant increase in the intralesional number in non inflammatory plaques, compared to healthy dogs. The inflammatory lesions showed a zonal, intralesional distribution of the astrocytes. Centrally there were only few astrocytes and the periphery demonstrated a gliotic border. An increase in the amount of CD3 and CD21 positive cells was found in the inflammatory plaques. The number of BS-1 positive macrophages / microglia was significantly increased in subacute plaques without inflammation and inflammatory lesions compared to healthy dogs and acute plaques.   The genes investigated, could be divided in three groups, each with a lesion-type dependent mRNA expression profile. There were genes with a significant down-regulation in the acute lesions (MMP-2), significant up-regulation mainly in the acute and subacute plaques without inflammation (MMP-9, MMP-12, TIMP-1, RECK) and others with only minor changes in the mRNA expression (MMP-13, MMP-14, TIMP-2). GAPDH mRNA was detected in all, CDV mRNA in all infected dogs.   Summarized, an up-regulation of the MMP-9 and MMP-12 expression in acute and subacute non inflammatory lesions of nervous distemper could possibly be an indicator for an initial, direct virally mediated degradation of the extracellular matrix. This might contribute to demyelination, because there is a positive correlation between the intralesional number of CDV-nucleoprotein-positive cells and MMP-12 mRNA expression. Both, the number of GFAP-positive astrocytes and the TIMP-1 and RECK mRNA expression are highest in the group with subacute lesions without inflammation, therefore it could be speculated, that TIMP-1 as well as RECK are expressed by astrocytes. This might lead to an inhibition of matrix degradation in the directly adjacent environment of the astrocytes. Therefore TIMP-1 and RECK might represent myelin-protecting factors.

Im Literaturteil erfolgt eine kurze Übersicht über die Klassifikation der Morbilliviren, ihr Wirtsspektrum und die Pathogenese der kaninen CDV-Infektion. Weiterhin wird eine kurze Zusammenfassung über die Pathogenese der demyelinisierenden Staupeenzephalitis des Hundes gegeben. Ein weiterer Teilaspekt widmet sich den Paramyxoviren als onkolytische Viren. Darüber hinaus werden die Klassifizierung, der Aufbau, die Aktivierung, die Regulation und die Substrate der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ihrer Inhibitoren erläutert und ihre Rolle anhand verschiedener physiologischer und pathologischer Prozesse verdeutlicht. Zusätzlich wird auf die Eigenschaften und Funktionen des Reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK) als MMP-Inhibitor eingegangen.   Im Rahmen einer Pilotstudie werden nicht infizierte und persistierend CDV-infizierte DH82-Zellen bezüglich ihrer MMP-mRNA-Expression mittels Reverser Transkriptase quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) verglichen. Bei der mRNA-Expression der untersuchten Gene ergaben sich drei Gruppen mit einem jeweils gemeinsamen Expressionsmuster. Es fanden sich Gene mit signifikant herabregulierter (MMP-2, TIMP-1, TIMP-2), signifikant aufregulierter (MMP-13, MMP-14, RECK) Expression in den persistierend CDV-infizierten DH82-Zellen und solche, mit nur unwesentlich veränderter Expression (MMP-9). GAPDH-mRNA war bei allen, CDV-mRNA bei allen persistierend infizierten DH82-Zellen nachweisbar.   Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es bei den persistierend CDV-infizierten DH82-Zellen zu einer ausgeprägten Herabregulierung der MMP-2-mRNA-Expression kommt. Zugleich liegt eine erhöhte RECK-Expression vor. Daraus lässt sich möglicherweise schließen, dass es zu einer Virus-induzierten, RECK-vermittelten Inhibition der proteolytischen Kapazität der DH82-Zellen kommt, die zu einer Reduktion der Invasivität dieser Zellen führen könnte. Widersprüchlich zu diesen Daten fand sich eine Erhöhung der mRNA-Expression, unter anderem von MMP-13 und MMP-14, was für das Vorhandensein einer proteolytischen Kaskade sprechen könnte, die ihrerseits die invasiven Eigenschaften der Zellen erhöht.    Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Kleinhirne von insgesamt 34 Hunden, von denen 26 eine CDV-Infektion aufwiesen und 8 einer klinisch gesunden Kontrollgruppe entstammten, untersucht.   Die histochemischen und immunhistologischen Untersuchungen sowie die RNA-Isolierung fanden an O.C.T. eingebetteten Kleinhirnproben statt. Hierbei wurden die Schnitte einer Hämatoxylin-Eosin (HE)- und einer Luxol-Fast-Blue Kresylechtviolett (LFB-KV)-Färbung zur Darstellung des Demyelinisierungsgrades unterzogen. Mittels Immunhistologie erfolgte der Nachweis von CDV-Nukleoprotein-Antigen und die Phänotypisierung der beteiligten Zellpopulationen mit Antikörpern, die Astrozyten (GFAP) und Lymphozyten (CD3, CD21) positiv markierten. Die Darstellung von Mikroglia und Makrophagen erfolgte mit dem Lektin BS-1. Die mRNA-Expression von MMP-2, -9, -12, -13, -14, TIMP-1, -2, RECK, CDV und GAPDH wurde mittels RT-qPCR untersucht.   Die Kontrolltiere und die CDV-infizierten Hunde wurden anhand des histologischen Bildes und des immunhistologischen Nachweises von CDV-Nukleoprotein in vier Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 bestand aus den gesunden Kontrolltieren, Gruppe 2 aus den Hunden mit akuten Läsionen, Gruppe 3 aus den Tieren mit subakuten, nicht entzündlichen Staupeherden mit Entmarkung und Gruppe 4 aus den Tieren mit entzündlichen, demyelinisierten Plaques.   Bei allen CDV-infizierten Tieren war CDV-Nukleoprotein-Antigen nachweisbar, wobei unterschiedlich starke Ausprägungen und Intensitäten vorlagen. CDV-mRNA war bei allen infizierten Tieren detektierbar. GFAP-positive Zellen waren in allen untersuchten Gruppen vorhanden, wobei sich eine signifikante Zunahme der intraläsionalen Anzahl bei subakuten, nicht entzündlichen Herden im Vergleich zu den Kontrolltieren ergab. Bei den entzündlichen Läsionen lag eine zonale, intraläsionale Verteilung der Astrozyten vor. Zentral waren nur noch wenige Astrozyten vorhanden, wohingegen in der Peripherie ein gliotischer Randsaum nachweisbar war. Eine Erhöhung der Anzahl CD3- und CD21-positiver Lymphozyten fand sich in der Gruppe der entzündlichen Herdveränderungen. Die Anzahl BS-1-positiver Makrophagen / Mikroglia war sowohl bei den subakuten Plaques ohne Entzündung als auch bei den entzündlichen Herden signifikant höher als bei den Kontrolltieren oder den Hunden mit akuten Läsionen.   Bei der mRNA-Expression der untersuchten Gene ergaben sich drei Gruppen mit einem jeweils gemeinsamen, läsionstypabhängigem Expressionsmuster. Es fanden sich Gene mit signifikant herabregulierter Expression in den akuten Herden (MMP-2), signifikant aufregulierter Expression vor allem in den akuten und subakuten Plaques ohne Entzündung (MMP-9, MMP-12, TIMP-1 und RECK) und solche mit nur unwesentlich veränderter Expression (MMP-13, MMP-14, TIMP-2). GAPDH-mRNA war bei allen, CDV-mRNA bei allen infizierten Tieren nachweisbar.   Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es in akuten und subakuten, nicht entzündlichen Läsionen der CDV-Infektion zu einer Aufregulierung der MMP-9- und MMP-12-mRNA-Expression kommt, was für eine initiale, direkt Virus-vermittelte Degradierung der extrazellulären Matrix sprechen könnte, die zur Demyelinisierung beiträgt, da eine positive Korrelation zwischen der Anzahl intraläsionaler CDV-Nukleoprotein-Antigen-positiver Zellen und der MMP-12-mRNA-Expression nachweisbar war. Sowohl die Anzahl GFAP-positiver Astrozyten, als auch die TIMP-1- und RECK-mRNA-Expression waren in der Gruppe mit subakuten Läsionen ohne Entzündung am höchsten, so dass vermutet werden kann, dass TIMP-1 und RECK von Astrozyten exprimiert werden. Dies könnte zu einer Hemmung der Matrixdegeneration in der direkten Umgebung der Astrozyten führen und somit könnten TIMP-1 und RECK Myelin-protektive Faktoren darstellen.

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Puff, Christina: Matrix-Metalloproteinasen und ihre Inhibitoren bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis des Hundes. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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