Die zentrale Rolle des Glutamatmetabolismus in der Stickstoffassimilation bei Mykobakterien

Ziel der Stickstoffassimilation von Bakterien ist die Synthese von Aminosäuren und anderen stickstoffhaltigen Bausteinen der Zelle. Je nach zur Verfügung stehender Stickstoffquelle finden in der Zelle verschiedene Umwandlungsprozesse statt, bevor es im letzten Teil der Stickstoffassimilation zum Einbau von Ammonium in Aminosäuren, bzw. in α-Ketoglutarat kommt. Glutamat und Glutamin sind hier die Angelpunkte und fungieren beide als Stickstoffdonatoren. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das als gltBD (Glutamatsynthase) annotierte Gencluster auf seine mögliche Funktion bei M. tuberculosis in vitro untersucht und getestet werden. Dazu sollte eine gltB- Deletionsmutante von M. tuberculosis angefertigt werden, die einen Defekt beim Ammoniaktransfer auf α-Ketoglutarat hat und somit auf diesem Weg kein Glutamat synthetisieren können sollte. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Funktionsassay zur Untersuchung einer solchen gltB- Deletionsmutante erstellt. Gesucht wurde ein Minimalmedium mit verschiedenen Ammoniumkonzentrationen als limitierende Stickstoffquelle, in denen das Wachstumsverhalten der Mutante beobachtet und mit dem Wachstum des Wildtyps verglichen werden konnte. Nach Wachstumsversuchen mit drei Minimalmedien, wurde das flüssige Proskauer und Beck (PB)- Medium als geeignetes Testmedium gewählt, da nur in diesem ein schnelles und Stickstoff-abhängiges Wachstum sowohl bei M. tuberculosis als auch bei M. bovis BCG beobachtet werden konnte. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Konstrukt mit einer Deletion im gltB- Gen erstellt und mittels Elektroporation in M. tuberculosis eingeschleust. Durch homologe Rekombination entstand eine Cointegrante, die sowohl das vollständige als auch das deletierte gltB- Gen enthielt. Das Ausloopen der Cointegrante zu einer gltB- Deletionsmutante schlug jedoch fehl. Die Cointegrante eliminierte in allen Versuchen den Plasmidbereich sowie das deletierte gltB- Gen und wurde somit wieder zum Wildtyp. Mit Hilfe eines bewährten und standardisierten Verfahrens war es nicht möglich, eine gltB- Deletionsmutante von M. tuberculosis zu erzeugen. Für dieses unerwartete Verhalten der Bakterien gibt es momentan noch keine Erklärung. Vermutet werden kann an dieser Stelle lediglich eine weitere, noch unbekannte Funktion des als gltBD annotierten, offensichtlich essentiellen Genclusters. Es besteht noch erheblicher Forschungsbedarf, um die genaue Funktion des als gltBD annotierten Genclusters bestimmen und die Regulierung des Stickstoffmetabolismus, insbesondere des Glutamatmetabolismus bei Mykobakterien genau verstehen zu können. Weitere Forschung auf diesem Gebiet wäre auf jeden Fall wünschenswert und aufschlussreich, um diese Erkenntnis in Zukunft für präventive, bzw. therapeutische Zwecke nutzen zu können.