Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die zentrale Rolle des Glutamatmetabolismus in der Stickstoffassimilation bei Mykobakterien

Ramm, Jennifer

The aim of nitrogen assimilation by bacteria is the synthesis of amino acids and other nitrogenous elements. Depending on the nitrogen source different pathways are utilized. However, the final product is always ammonium, which is integrated into the cell`s metabolism via glutamate and glutamaine. The aim of this work was to examine the function of gltBD (glutamatesynthase) in M. tuberculosis by construction of a gltB deletion mutant. This mutant should be unable to transfer ammonium onto α-Ketoglutarat and to produce glutamate in this way. In the first part of the present study an assay for examination of such a gltB deletion mutant was developed. We sought to find a minimalmedium with different concentration of ammonium as a limiting nitrogen source, in which growth of the mutant could be compared with growth of wild typ mycobacteria. After testing three minimal mediums, liquid Proskauer and Beck (PB) Medium was chosen because of fast and nitrogen dependent growth of M. tuberculosis and M. bovis BCG. In the second part of the study a construct with a deletion in gltB gene was generated and transformed into M. tuberculosis using electroporation. Via homologous recombination we obtained a cointegrant, containing the the deleted gltB gene next to the wild typ gltB. However, the second recombination step to eliminate the plasmid together with the wild typ gene failed. Instead, all clones turned out to be wild typ strains. Via an established and standardized method it was not possible to generate a gltB deletion mutant of M. tuberculosis. At the moment there is no explanation for such an unexpected behavior by bacteria. An assumption is an unknown function of the obviously essentiell gltBD (glutamatesynthase) annotated gene cluster in M. tuberculosis. There is still large need for research to determine exact function of gltB and understand regulation of nitrogen metabolism, especially glutamate metabolism in mycobacteria. More research in this sector would be preferable and informative.

Ziel der Stickstoffassimilation von Bakterien ist die Synthese von Aminosäuren und anderen stickstoffhaltigen Bausteinen der Zelle. Je nach zur Verfügung stehender Stickstoffquelle finden in der Zelle verschiedene Umwandlungsprozesse statt, bevor es im letzten Teil der Stickstoffassimilation zum Einbau von Ammonium in Aminosäuren, bzw. in α-Ketoglutarat kommt. Glutamat und Glutamin sind hier die Angelpunkte und fungieren beide als Stickstoffdonatoren. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das als gltBD (Glutamatsynthase) annotierte Gencluster auf seine mögliche Funktion bei M. tuberculosis in vitro untersucht und getestet werden. Dazu sollte eine gltB- Deletionsmutante von M. tuberculosis angefertigt werden, die einen Defekt beim Ammoniaktransfer auf α-Ketoglutarat hat und somit auf diesem Weg kein Glutamat synthetisieren können sollte. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Funktionsassay zur Untersuchung einer solchen gltB- Deletionsmutante erstellt. Gesucht wurde ein Minimalmedium mit verschiedenen Ammoniumkonzentrationen als limitierende Stickstoffquelle, in denen das Wachstumsverhalten der Mutante beobachtet und mit dem Wachstum des Wildtyps verglichen werden konnte. Nach Wachstumsversuchen mit drei Minimalmedien, wurde das flüssige Proskauer und Beck (PB)- Medium als geeignetes Testmedium gewählt, da nur in diesem ein schnelles und Stickstoff-abhängiges Wachstum sowohl bei M. tuberculosis als auch bei M. bovis BCG beobachtet werden konnte. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Konstrukt mit einer Deletion im gltB- Gen erstellt und mittels Elektroporation in M. tuberculosis eingeschleust. Durch homologe Rekombination entstand eine Cointegrante, die sowohl das vollständige als auch das deletierte gltB- Gen enthielt. Das Ausloopen der Cointegrante zu einer gltB- Deletionsmutante schlug jedoch fehl. Die Cointegrante eliminierte in allen Versuchen den Plasmidbereich sowie das deletierte gltB- Gen und wurde somit wieder zum Wildtyp. Mit Hilfe eines bewährten und standardisierten Verfahrens war es nicht möglich, eine gltB- Deletionsmutante von M. tuberculosis zu erzeugen. Für dieses unerwartete Verhalten der Bakterien gibt es momentan noch keine Erklärung. Vermutet werden kann an dieser Stelle lediglich eine weitere, noch unbekannte Funktion des als gltBD annotierten, offensichtlich essentiellen Genclusters. Es besteht noch erheblicher Forschungsbedarf, um die genaue Funktion des als gltBD annotierten Genclusters bestimmen und die Regulierung des Stickstoffmetabolismus, insbesondere des Glutamatmetabolismus bei Mykobakterien genau verstehen zu können. Weitere Forschung auf diesem Gebiet wäre auf jeden Fall wünschenswert und aufschlussreich, um diese Erkenntnis in Zukunft für präventive, bzw. therapeutische Zwecke nutzen zu können.

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Ramm, Jennifer: Die zentrale Rolle des Glutamatmetabolismus in der Stickstoffassimilation bei Mykobakterien. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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