Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Verifizierung der Glykosaminglykan (GAG)-Bindungsstelle des CC-Chemokins CCL14 und funktionelle Charakterisierung einer defizienten Mutante

Rieder, Sebastian

Chemokines are chemotactic, heparin-binding peptides. They direct migrating leukocytes to sites of inflammation and maintain the homeostasis of the immune system. Predominantly, chemokines  are found in inflamed tissue or bound on the luminal surface of endothelial cells. To resist the sheer forces of the blood flow and in order to build up a haptotactic concentration gradient, chemokines are immobilized by glycosaminoglycanes (GAG) and likewise presented to circulating leukocytes. Specific GAG-binding sites have already been identified for a couple of chemokines. In CCL3, CCL4, CCL5, and CXCL12, this specific binding site is represented by an BBXB-motif (B = basic amino acid, X = any other amino acid). In the scope of this thesis, it could be verified that CCL14 comprises a BBXB-motif within the amino acids 49-52. The basic amino acids of NNY-CCL14(G50,A51) were replaced by neutral amino acids, which resulted in a reduction of its heparin binding affinity.   The biological activity of NNY-CCL14(G50,A51) was tested either in CCR1, CCR3 and CCR5-stably transfected cell lines or in freshly isolated eosinophils and monocytes. Receptor internalization was measured by flow cytometry, mobilization of intracellular calcium was determined using the FLIPR method and in vitro chemotaxis was carried out by microchemotaxis assays. The GAG-deficient mutant of CCL14, NNY-CCL14(G50,A51), showed only a moderate reduction of its activity on CCR1 which was more evident in the measurement of intracellular calcium fluxes than in receptor internalization. While the activity of NNY-CCL14(G50,A51) on CCR3 was lost completely, all investigated biological functions mediated via CCR5 were unaltered. Previous studies showed that according to CCR1 and CCR5, these results are essentially in line with the observations on CCL3, CCL4 and CCL5. Recently, it was shown for NNY-CCL14, the precursor of the GAG-deficient mutant, that airway hyperresponsiveness is significantly reduced after intravenous application of NNY-CCL14 in a murine model of allergic airway inflammation. Furthermore, it is described for CCL5 that the neutralization of the BBXB motif leads to a reduced cell recruitment in vivo. Therefore, these in vitro experiments are the basis for future in vivo studies  contributing to a better understanding of the pathophysiological mechanisms in allergic diseases and may lead to innovative pharmacological interventions in this context. These results pave the way for the design of new clinically relevant chemokine derivates.

Chemokine sind chemotaktisch aktive, Heparin-bindende Peptide. Im Rahmen der Homöostase des Immunsystems und während einer Entzündung dirigieren Chemokine die Migration der Leukozyten zu ihren Zieladressen. Vornehmlich findet man Chemokine in Entzündungsgeschehen sezerniert oder an die Oberfläche von Endothelzellen gebunden. Um den Scherkräften des Blutstroms standhalten zu können und einen lokalen Konzentrationsgradienten zu bilden, werden Chemokine an Glykosaminoglykane (GAG) gebunden und so den zirkulierenden Leukozyten präsentiert. Für einige Chemokine konnten spezifische Bindungsstellen der Glykosaminoglykane bereits identifiziert werden. In CCL3, CCL4, CCL5 und CXCL12 wird diese spezifische Bindungsstelle durch ein BBXB-Motiv (B = basische Aminosäure; X = beliebige andere Aminosäure) repräsentiert. In CCL14 liegt ein solches Motiv im Bereich der Aminosäuren 49-52 vor. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen durchgeführt, bei denen die basischen Aminosäuren durch neutrale ersetzt wurden. Dies führt zu einem Verlust der Bindungsaffinität zu Heparin.   Die biologische Aktivität von NNY-CCL14(G50,A51) wurde sowohl an CCR1-,CCR3- und CCR5-transfizierten 300.19 Zelllinien als auch an frisch isolierten eosinophilen Granulozyten und Monozyten getestet. Zur Bestimmung der Aktivität wurde die Rezeptorinternalisierung mit der Durchflußzytometrie, die Messung der Mobilisation von intrazellulärem Calcium mit der FLIPR-Methode und die chemotaktische Aktivität in Mikrochemotaxisassys in vitro gemessen. NNY-CCL14(G50,A51) verlor nur moderat an Aktivität am CCR1. Der Verlust war in der Messung der Calciummobilisation deutlicher zu erkennen als in der Messung der Rezeptorinternalisierung. Während ein vollständiger Aktivitätsverlust am CCR3 gezeigt wurde, blieb die Aktivität am CCR5 vollständig erhalten. Frühere Studien zeigten, dass in Bezug auf CCR1 und CCR5, diese Resultate mit denen von CCL3, CCL4 und CCL5 im Wesentlichen übereinstimmen. Kürzlich konnte für den Precursor der GAG-Bindungsstellen-defizienten Mutante, NNY-CCL14, gezeigt werden, dass die Hyperreaktivität der Atemwege in einem murinen Versuchsmodell nach intravenöser Applikation von NNY-CCL14 gemindert wird. Weiter konnte für CCL5 dargestellt werden, dass eine Neutralisation des BBXB-Motivs die Zellrekrutierung in vivo verhindert.   Dementsprechend bilden die in vitro Versuche dieser Studie die Grundlage für spätere in vivo Versuche, die zu einem besseren Verständnis der pathophysiologischen Mechanismen und der pharmakologischen Interventionsmöglichkeiten bei allergischen Erkrankungen beitragen können. Die Ergebnisse weisen auf neue Wege hin, die für die Entwicklung klinisch relevanter Chemokinderivate von großer Bedeutung sind.

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Rieder, Sebastian: Verifizierung der Glykosaminglykan (GAG)-Bindungsstelle des CC-Chemokins CCL14 und funktionelle Charakterisierung einer defizienten Mutante. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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