Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Das juvenile Schaf als Modelltier für orthopädische Studien

Schiborra, Frederike

A commonly used animal model in human orthopaedic research is the sheep. Research topics concerning the growing musculoskeletal tissues of children necessitate the use of skeletally immature animals. To identify pathological situations, it is essential to know the physiological variations during development. In mature individuals, tendon, ligament, meniscus and articular cartilage are known as quiescent tissues. Their structure and composition is adapted to their biomechanical function. There is a constant turnover of the extracellular matrix, but these are low level activities. The objective of this study was to differentiate the developmental changes of the tendon, cranial cruciate ligament, medial meniscus and femoral articular cartilage during the first 40 weeks in sheep. Histological, immunohistochemical, molecular biological and biomechanical methods were used. The identification of the production of several growth factors and structural proteins was the focus of the immunohistochemical and molecular biological study. The tissues were harvested from one, eight, 18, 22, 28 and 40 weeks old sheep. In the histological study, changes in cell density, cell and nucleus morphology, blood vessel density as well as the structure of the extracellular matrix could be identified with qualitative and histomorphometric analysis of hematoxylin & eosin and Azan stained, paraffin-embedded sections. The basic formation of the different tissues was already visible in the one week old sheep. The cell and blood vessel density was decreasing in all tissues. The maturation of the articular cartilage showed distinct organisational processes and it developed from an irregular, hypercellular tissue to a complex structure of four distinguishable zones. The least changes displayed the meniscus. It was differentiated in three zones in the one week old and only a few changes could be identified afterwards. In comparison to existing data from humans a 18 week old sheep might be comparable to a 6 to 10 years old child. Immunohistochemistry showed positive staining for α-smooth muscle actin (ASMA), vascular endothelial growth factor (VEGF) and transforming growth factor-β (TGF-β) in the maturing tissues of the sheep. There was no positive reaction for VEGF and TGF-β in articular cartilage. VEGF and ASMA were most present in cells of the one week old sheep. With increasing age, the positive staining was decreasing. This decrease was tissue and antigen specific. TGF-β could be identified in the tendon and ligament at a constantly low level in all age groups. For the molecular biological study, qRT-PCR assays for the growth factors VEGF, TGFB2, platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF2) and bone morphogenetic growth factor 2 (BMP2) and the structural proteins collagen type I-III and ASMA were designed. With each assay the cDNA of the target genes could be amplified successfully. The expression of most growth factors changed during maturation and the maximal expression was determined in the first eight weeks of life. With some exceptions, the expression showed a decrease over time. VEGF and FGF2 in the tendon and ligament presented a constant expression, while BMP2 in the ligament and TGFB2 in the tendon increased during development. The biomechanical properties of the femoral articular cartilage were determined for the cartilage of 22, 28 and 40 week old sheep via indention testing. The elastic modulus was calculated from the maximal displacement at the equilibrium and the cartilage thickness. Values of  0,633±0,172 MPa, 0,686±0,216 MPa and 0,9±0,146 MPa resulted for the 22, 28 and 40 weeks old sheep, respectively. There was no significant difference between the 22 and 28 weeks group (p=0,6). The cartilage stiffness of the 40 weeks group differed significantly from the 22 weeks group (p=0,013) and the 28 weeks group (p=0,029). This indicates an increase in stiffness during maturation. The results of these investigations allow a comparison of the histological, molecular biological and biomechanical properties of the sheep with other animal species and humans during maturation and growth. The choice of the appropriate animal model and age for studies of the musculoskeletal system in skeletally immature individuals could be made easier and the comparability be supported.

In der humanmedizinischen Forschung wird das Schaf häufig als Modelltier für orthopädische Fragestellungen eingesetzt. Für Studien über das wachsende Skelett werden juvenile Tiere eingesetzt werden. Zur Definition von pathologischen Situationen müssen zunächst die physiologischen Veränderungen während des Wachstums bekannt sein. Im adulten Individuum gelten Sehnen, Bänder, Meniskus und Gelenkknorpel im Allgemeinen als wenig aktive Gewebe. Sie sind in Aufbau und Zusammensetzung den mechanischen Belastungen angepasst. Zwar wird die vorhandene Matrix laufend durch neue ersetzt (Erhaltungsumsatz), es handelt sich dabei jedoch um Aktivitäten auf niedrigem Niveau. Ziel dieser Studie war es, die postnatale Entwicklung von Sehne, Kreuzband, Meniskus und Gelenkknorpel beim Schaf in den ersten 40 Lebenswochen darzustellen. Immunhistochemisch und molekularbiologisch wurde insbesondere die Produktion von Wachstumsfaktoren und Strukturproteinen untersucht. Die untersuchten Gewebe stammten von Tieren im Alter von einer, acht, 18, 22, 28 und 40 Wochen. Histologisch wurde eine qualitative Auswertung und histomorphometrische Analyse durchgeführt. Unterschiede in der Zelldichte, Zell- und Kernmorphologie, Blutgefäßdichte sowie der Struktur der extrazellulären Matrix konnten identifiziert werden. Der grundsätzliche Aufbau der Gewebe war schon bei einem einwöchigen Tier gegeben. Die Zell- und Gefäßdichte nahm in allen Geweben ab. Der Entwicklungsprozess des Knorpels zeigte deutliche Veränderungen in der Struktur, von einem wenig geordneten, hyperzellulären Gewebe zu einem komplexen Gefüge mit vier differenzierbaren Zonen. Die wenigsten Veränderungen wies der Meniskus auf. Die Differenzierung in drei Zonen war im einwöchigen Tier schon deutlich und über die Zeit zeigten sich kaum Veränderungen. Vergleiche zu exitierenden Daten vom Menschen, lassen eine ungefähre Korrelation eines 18 Wochen alten Schafes mit den Geweben eines 6-10 jährigen Kindes zu. Mittels immunhistochemischer Methoden konnte ein Nachweis von α-smooth muscle actin (ASMA), vascular endothelial growth factor (VEGF) und transforming growth factor-β (TGF-β) in den gesunden Geweben der wachsenden Schafe erbracht werden. Im Knorpel war weder VEGF noch TGF-β detektierbar. VEGF und ASMA zeigten im einwöchigen Tier das deutlichste Auftreten. In den älteren Tieren nahm die Dichte der positiv markierten Zellen ab. Je nach Gewebe und Antigen variierte die Abnahme im Verlauf des Wachstums. Der Nachweis von TGF-β in der Sehne und dem Kreuzband konnte konstant in jedem Alter auf geringem Niveau erbracht werden. Zur Genexpressionsanalyse mit der qRT-PCR wurden Assays für die Wachstumsfaktoren VEGF, TGF-β, platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF2) und bone morphogenetic growth factor 2 (BMP2) sowie für die Strukturproteine Kollagen Typ I-III und ASMA etabliert. Mit den entwickelten Assays konnte die cDNA jedes Zielgens erfolgreich und spezifisch amplifiziert werden. Die höchste Expression der Mehrzahl der Wachstumsfaktoren war während der ersten acht Lebenswochen zu ermitteln. Mit wenigen Ausnahmen zeigten die untersuchten Zielgene mit zunehmendem Alter eine sinkende Tendenz der Expression. Die VEGF und FGF2 Expression in der Sehne und dem Kreuzband blieb weitgehend konstant, während die Expression von BMP2 im Kreuzband und von TGFB2 in der Sehne anstieg. Die biomechanischen Eigenschaften des femoralen Gelenkknorpels wurden von Schafen im Alter von 22, 28 und 40 Wochen mittels der Indentationsmessung ermittelt. Aus den ermittelten Werten für die Kompression im Equilibrium und der Knorpeldicke wurde der Elastizitätsmodul errechnet. Daraus ergaben sich Werte von 0,633±0,172, 0,686±0,216 bzw. 0,9±0,146 MPa für die 22, 28 bzw. 40 Wochen alten Tiere. Die 22 und 28 Wochen Gruppe unterschieden sich damit nicht signifikant. Der Knorpel der 40 Wochen Gruppe war aber signifikant steifer als der Knorpel der 22 Wochen Gruppe (p=0,013) und der 28 Wochen Gruppe (p=0,029). Die Steifigkeit des Knorpels nahm somit während des Wachstums zu. Die Ergebnisse der hier vorgenommenen Untersuchungen ermöglichen einen Vergleich der histologischen, molekularbiologischen und biomechanischen Gegebenheiten mit denen anderer Tierspezies und des Menschen während des Wachstums. Die Wahl eines Modelltieres und der passenden Altersstufe für zukünftige Studien an wachsenden Individuen kann damit erleichtert und die Vergleichbarkeit der Untersuchungen unterstützt werden.

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Schiborra, Frederike: Das juvenile Schaf als Modelltier für orthopädische Studien. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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