Optimierung der Embryonenzahl für die Kryokonservierung transgener Mäuse

Schwab, Anna

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Optimierung der Embryonenzahl für die Kryokonservierung transgener Mäuse

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Die Kryokonservierung früher Embryonalstadien ist eine zuverlässige Technologie, um wertvolle transgene Mauslinien ohne Zuchterhalt zu sichern. Im DKFZ Heidelberg werden seit etwa zehn Jahren konsequent transgene Mäuse kryokonserviert. Dabei schwankt die Zahl der Embryonen, die aus speziell für die Kryokonservierung angesetzten Verpaarungen erhalten werden, erheblich und wird somit zu einem der limitierenden Faktoren. In dieser Dissertation werden mit dem Datenmaterial von 95000 kryokonservierten Embryonen die Ursachen für diese Schwankungen untersucht und nach Möglichkeiten für eine höhere Effizienz gesucht. Die Daten zeigen, dass ein erheblicher Umwelteinfluss auf den Haltungsbereich und die dort vorhandene Technik besteht, unter anderem weil extreme Witterungsbedingungen selbst starke Klimaanlagen überfordern und bis zu einem regelrechten Zusammenbruch der Zucht führen können. So entsteht in Abhängigkeit der Wetterbedingungen ein eigenes Jahresprofil für jedes Tierlabor, was auch an Hand von Daten aus anderen Tierlabors gezeigt wurde. Besonders wichtig ist eine hygienisch einwandfreie Tierhaltung: In einer MPV- (murines Parvovirus) infizierten Haltung reduzierte sich innerhalb weniger Monate die Zahl der erhaltenen Embryonen (insgesamt und je Spendertier) dramatisch. Auch biologische Gründe spielen eine erhebliche Rolle, herausragend ist der genetische Hintergrund: Hybrid- oder Auszuchtmäuse hatten deutlich bessere Zuchterfolge als die für die Transgenese sehr beliebten C57/BL6 Inzuchtmäuse. Das vorhandene Datenmaterial zeigt auch, dass eine dreiwöchige Verpaarungsfrequenz der männlichen (transgenen) Tiere am effektivsten ist. Um das Verfahren nach der Superovulation zu optimieren, wurde ein möglicher Einfluss Pheromon bedingter Effekte untersucht: Der Lee-Boot Effekt beschreibt eine Zyklussuppression bei in großen Gruppen gehaltenen weiblichen Tieren, wie dies in Tierhaltungen häufig der Fall ist. Bei bis zu vier Tieren großen Gruppen erhielten wir im Durchschnitt eineinhalb Mal mehr Embryonen je Spendertier, in Einzelfällen bis zu vierzig Mal mehr. Der Whitten Effekt (Zyklus synchronisierender Effekt), der durch eine Exposition des weiblichen Tieres zu den Pheromonen eines männlichen Tieres ausgelöst wird, führte im Mittel zu einer Steigerung der Embryonenausbeute um den Faktor 2,4. Beide Effekte zeigten auch eine Erhöhung der Anzahl ovulierter Oocyten. Die hier gezeigten Ergebnisse führen zu einer höheren Effektivität der Embryonengewinnung und tragen somit zum Tierschutz bei.

The cryopreservation of early embryonic stages is a powerful tool to save and to handle the increasing number of transgenic mouse lines. Cryopreservation of transgenic mice is being done at the DKFZ in Heidelberg since ten years. However, the outcome of embryos varies from line to line. Using the data of 95000 cryopreserved embryos the reasons for these variances were elucidated and possibilities to raise the efficiency were investigated. Environmental effects influence the climate of the facility. Extreme weather conditions are not fully compensated by the air conditioning supply even if powerful equipments are used. This results in a specific season profile for each facility. Data of other facilities show the same behaviour. A MPV- (mouse parvo virus) infection of mice housed in a SPF-facility enabled the bad opportunity to analyse its impact on mating and the number of embryos obtained. Within a couple of months following the detection of the infection the efficiency of breeding collapsed. Biological influences also play an important role, e.g. the genetic background: While hybrid and outbred mice are very active, C57BL/6 inbred mice most common for transgenesis provide the smallest efficiency. Furthermore, male transgenic mice show the highest success in mating with a breeding interval of three weeks. To optimize the cryopreservation technique, especially in case of “difficult” lines, pheromonal effects were investigated. The Lee-Boot Effect describes an estrous suppression caused by group sizes of more than four females per cage. Mating of females housed in groups of a maximum of four mice delivered more embryos than their controls (average: factor of 1.5, the factor 40 was detected in one case). The Whitten Effect (cycle synchronizing effect) induces ovulation following the exposure to the male: In this case the efficiency was raised up to a factor of 2.4. The data presented here show possibilities to reduce the number of animals needed for cryopreservation and are subsequently a contribution to the animal welfare.