Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zum transepithelialen Calcium-Transport beim Schaf

Wilkens, Mirja, Rosmarie

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Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zum transepithelialen Calcium-Transport beim Schaf

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Aus zahlreichen funktionellen Untersuchungen ist bekannt, dass sich Lokalisation und genaue Mechanismen der gastrointestinalen Calcium-Resorption des Wiederkäuers von den Verhältnissen bei monogastrischen Tieren zumindest teilweise unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Duodenum, Jejunum, Labmagen, Pansen und Niere des Schafes daraufhin untersucht, inwieweit die Strukturen, die beim monogastrischen Tier als Voraussetzung für den aktiven, transepithelialen Calcium-Transport angesehen werden, auch beim Wiederkäuer darstellbar sind. Zum Nachweis der beiden epithelialen Calciumkanäle TRPV5 und TRPV6, der cytosolischen, Calcium bindenden Proteine Calbindin-D9K und Calbindin-D28K und der basolateralen Ausschleusungsmechanismen, dem Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) und der membranständigen Ca2+-ATPase (PMCA), mittels RT-PCR wurden Primer in Analogie zu bekannten Sequenzen anderer Spezies generiert. Um die RNA-Expression von TRPV5 und TRPV6 auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde eine In-situ-Hybridisierung mit DIG-markierten RNA-Sonden durchgeführt. Auf Protein-Ebene konnten mithilfe kommerziell erhältlicher Antikörper bzw. Antiseren die epithelialen Calciumkanäle sowie die Calbindine immunhistochemisch gezeigt werden. Darüber hinaus wurde der Transport von Calcium über das Labmagenepithel mittels Ussing-Kammer-Technik funktionell charakterisiert, da über die Rolle des Labmagens für die gastrointestinale Calcium-Resorption bislang relativ wenig bekannt war. In den beiden Dünndarmabschnitten konnten alle Komponenten des für den Monogastrier postulierten, transepithelialen Calcium-Transport-Modells nachgewiesen werden. Dieser Befund ist insofern überraschend, als dass es bislang nicht gelungen war, beim Schaf funktionell entsprechende Calcium-Nettofluxraten zu zeigen. Auch in der Niere liegt den strukturellen Untersuchungen nach zu urteilen prinzipiell das gleiche System zur Rückresorption von Calcium vor wie beim monogastrischen Tier, bezüglich der exakten Lokalisation von TRPV5 entlang des Nephrons ergeben sich aber Unterschiede. Im Pansen konnten weder die epithelialen Calcium-Kanäle noch die Calbindine in der typischen Anordnung nachgewiesen werden. NCX und PMCA konnten zwar mittels RT-PCR im Pansenepithel gezeigt werden, über ihre genaue Lokalisation innerhalb des Gewebeverbandes ließ sich jedoch keine Aussage treffen. Diese Befunde unterstützen die aus funktionellen Untersuchungen abgeleitete Hypothese eines alternativen transzellulären Calcium-Transportes über das Pansenepithel, bei dem der apikale Einstrom der Calcium-Ionen über einen Ca2+/H+-Austauscher erfolgen könnte und damit von der luminalen Konzentration der freien Fettsäuren beeinflussbar wäre. Im Labmagen konnten zwar beide epithelialen Calciumkanäle, Calbindin-D9K, NCX und PMCA nachgewiesen werden, aufgrund des niedrigen Expressionsgrades und der Verteilung der Proteine auf zellulärer Ebene ist aber nicht davon auszugehen, dass in diesem Organ aktiv Calcium in relevanten Mengen resorbiert wird. Die Ergebnisse der funktionellen Untersuchungen ergaben ebenfalls keinerlei Hinweise auf einen aktiven, transzellulären Calcium-Transport über das Labmagenepithel.

From several functional investigations it is known that there are differences concerning the specific mechanisms and localization of calcium absorption between ruminants and monogastric animals. Therefore, it was the aim of this study to clarify whether the structures known to be crucial for active, transcellular absorption of calcium in monogastric animals can also be shown in duodenum, jejunum, abomasum, rumen and kidney of the sheep. Expression of the two epithelial calcium channels TRPV5 (“transient receptor potential vanilloid”) and TRPV6, the cytosolic calcium binding proteins calbindin D9K and calbindin D28K and the basolateral extrusion mechanisms, Na+/Ca2+ exchanger (NCX) and the membrane-associated Ca2+-ATPase (PMCA) was shown by RT-PCR. Primers were designed by using alignments of sequences of other species. Characterization of TRPV5 and TRPV6 RNA expression patterns by in situ hybridization was carried out using DIG labelled RNA probes. The epithelial calcium channels and the calbindins could be shown by immunohistochemistry using commercially available antibodies and antisera. In addition, the transport of calcium across the abomasal epithelium was functionally characterized by means of Ussing chamber technology since there is only few information about the role of the abomasum in gastrointestinal calcium absorption so far. In both sections of the small intestine all components of the model of transcellular calcium transport postulated for monogastric animals could be found. As it has not been possible to show corresponding calcium net fluxes in functional studies so far, these results are rather surprising. According to the structural analysis, there is the same system for reabsorption of calcium present in the kidney of ruminants. However, there are differences between the kidney of sheep and other species investigated so far concerning the respective localization of TRPV5 along the nephron. Neither the epithelial calcium channels nor the calbindins could be found in the typical tissue distribution in the rumen. NCX and PMCA could be shown by means of RT-PCR, although there is no further information about expression patterns. These findings support the hypothesis of an alternative transcellular calcium transport in the rumen. As concluded from functional studies, which confirmed the influence of the concentration of short chain fatty acids on ruminal calcium transport, the possibility of an apical influx of the calcium ions via a putative Ca2+/H+-exchanger is still under discussion. In the abomasum, both epithelial calcium channels, calbindin-D9K, NCX and PMCA could be detected. Due to the low level of expression and the distribution of the proteins on the cellular level, the abomasum is not considered to play an important role in gastrointestinal calcium absorption. Likewise, the results of the functional investigations did not point to an active, transcellular calcium transport across the abomasal epithelium.