Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung und in vitro Expression einer Protein Disulfid Isomerase (PDI) zur Immunisierung gegen Dictyocaulus viviparus

Wolken, Sonja

Dictyocaulosis is one of the most important parasitic diseases in grazing cattle with high economic impact. Since natural infections stimulate a protective immunity and good results were optained with an attenuated live vaccine, development of a recombinant vaccine seems to be feasible. Protein disulfide isomerase, an enzyme whose immunogenicity has been discribed in other helminths, was choosen as a vaccine candidate. Using degenerate primers, a central part of the PDI sequence in Dictyocaulus viviparus was identified. To complete the sequence, 5’- and 3’-rapid amplification of cDNA ends (RACE) was used. The full length sequence contains an open reading frame of 1482 bp and presents 80% identity to PDI of Ancylostoma caninum and Teladorsagia circumcincta as well as to PDI2 of Ostertagia ostertagi and 72% identity to PDI2 of Caenorhabditis elegans. Therefore the identified PDI was described as PDI2 of D. viviparus. The amino acid sequence shows two thioredoxin domains. These highly conserved regions contain the active sites for the enzyme activity. The genomic sequence of the PDI2 has a length of 2649 bp and consists of five exons and four introns, the introns being located at exactly the same positions as in the A. caninum sequence. This demonstrates the conserved organization of this gene. When using degenerate primers, a second PDI sequence of D. viviparus was identified. This PDI shows highest identities to PDI1 of O. ostertagi and to PDI3 of C. elegans. The PDI2 was expressed as GST fusion protein in E. coli and purified via affinity chromatography. The immunogenicity of the recombinant protein was demonstrated in western-blots using sera of cattle experimentally infected with D. viviparus. In two immunization trials the protective potential of the fusion protein in combination with the adjuvants Al(OH)3 and Quil A was tested in a total of 22 cattle. Despite the existence of PDI specific antibodies in all vaccinated cattle, the recombinant protein failed to induce protection against challenge. Neither in larvae counts nor in worm burdens a statistical significance in reduction was seen. Calves that had received Quil A showed a tendency to have lower total larvae counts, but it was not clear whether this effect was due to a specific immunresponse. Furthermore all immunized calves harboured worms that were 7,2% to 18% shorter than those of the control group. But again this was not statistical significant.

Die Dictyocaulose ist eine der wirtschaftlich bedeutsamsten parasitären Erkrankungen der Weiderinder. Die im natürlichen Infektionsgeschehen vorhandene Ausbildung einer protektiven Immunität und Erfolge mit einer Larvenvakzine lassen die Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffs möglich erscheinen. Als Vakzinekandidat wurde das Enzym Protein Disulfid Isomerase gewählt, dessen immunogene Eigenschaften bereits bei anderen Helminthen beschrieben worden waren. Mittels degenerierter Primer konnte ein zentraler Abschnitt der PDI-Sequenz bei Dictyocaulus viviparus identifiziert werden, welcher durch 5’- und 3’-Rapid Amplifikation of cDNA Ends (RACE) vervollständigt wurde. Die hieraus resultierende Sequenz weist einen offenen Leserahmen über 1482 bp auf und zeigt eine 80%ige Identität zur PDI von Ancylostoma caninum und Teladorsagia circumcincta sowie zur PDI2 von Ostertagia ostertagi und eine 72%ige Identität zur PDI2 von Caenorhabditis elegans. Diese Identitäten resultierten in der Beschreibung der identifizierten PDI als PDI2 von D. viviparus. Die Aminosäurensequenz weist zwei Thioredoxin-Domänen auf, wobei es sich um hochkonservierte Bereiche handelt, in denen die katalytisch aktiven Zentren des Enzyms lokalisiert sind. Die genomische Sequenz der PDI2 hat eine Größe von 2649 bp und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Die Positionen der Introns im Gen stellen sich im Vergleich mit der A. caninum-Sequenz als vollständig konserviert dar. Die degenerierten Primer identifizierten eine zweite PDI bei D. viviparus mit höchsten Identitäten zur PDI1 von O. ostertagi und zur PDI3 von C. elegans. Die PDI2 wurde als GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und mittels Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt. Die Immunogenität des rekombinanten Proteins konnte im Western-Blot anhand von Serum experimentell mit D. viviparus infizierter Rinder nachgewiesen werden. In zwei verschiedenen Immunisierungsversuchen erfolgte an insgesamt 22 Rindern die Überprüfung des protektiven Potentials des GST-PDI-Fusionsproteins in Kombination mit den Adjuvantien Al(OH)3 und Quil A. Trotz des Vorhandenseins PDI-spezifischer Antikörper bei allen immunisierten Tieren konnte durch die Impfung kein Schutz gegen eine experimentelle Infektion vermittelt werden. Weder in der Larvenausscheidung noch in Bezug auf die Wurmbürde konnte eine statistisch signifikante Reduktion festgestellt werden. Tendenziell zeigten Tiere, die das Adjuvans Quil A erhalten hatten, eine geringere Larvenausscheidung, wobei unklar ist, ob es sich hierbei um eine spezifische Immunreaktion handelte. Weiterhin war bei allen immunisierten Tieren eine Reduktion der Wurmgröße zwischen 7,2 und 18% im Vergleich zur Kontrollgruppe zu beobachten, die jedoch ebenfalls keine statistische Signifikanz erreichte.

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Wolken, Sonja: Charakterisierung und in vitro Expression einer Protein Disulfid Isomerase (PDI) zur Immunisierung gegen Dictyocaulus viviparus. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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