Charakterisierung und in vitro Expression einer Protein Disulfid Isomerase (PDI) zur Immunisierung gegen Dictyocaulus viviparus

Die Dictyocaulose ist eine der wirtschaftlich bedeutsamsten parasitären Erkrankungen der Weiderinder. Die im natürlichen Infektionsgeschehen vorhandene Ausbildung einer protektiven Immunität und Erfolge mit einer Larvenvakzine lassen die Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffs möglich erscheinen. Als Vakzinekandidat wurde das Enzym Protein Disulfid Isomerase gewählt, dessen immunogene Eigenschaften bereits bei anderen Helminthen beschrieben worden waren. Mittels degenerierter Primer konnte ein zentraler Abschnitt der PDI-Sequenz bei Dictyocaulus viviparus identifiziert werden, welcher durch 5’- und 3’-Rapid Amplifikation of cDNA Ends (RACE) vervollständigt wurde. Die hieraus resultierende Sequenz weist einen offenen Leserahmen über 1482 bp auf und zeigt eine 80%ige Identität zur PDI von Ancylostoma caninum und Teladorsagia circumcincta sowie zur PDI2 von Ostertagia ostertagi und eine 72%ige Identität zur PDI2 von Caenorhabditis elegans. Diese Identitäten resultierten in der Beschreibung der identifizierten PDI als PDI2 von D. viviparus. Die Aminosäurensequenz weist zwei Thioredoxin-Domänen auf, wobei es sich um hochkonservierte Bereiche handelt, in denen die katalytisch aktiven Zentren des Enzyms lokalisiert sind. Die genomische Sequenz der PDI2 hat eine Größe von 2649 bp und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Die Positionen der Introns im Gen stellen sich im Vergleich mit der A. caninum-Sequenz als vollständig konserviert dar. Die degenerierten Primer identifizierten eine zweite PDI bei D. viviparus mit höchsten Identitäten zur PDI1 von O. ostertagi und zur PDI3 von C. elegans. Die PDI2 wurde als GST-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und mittels Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt. Die Immunogenität des rekombinanten Proteins konnte im Western-Blot anhand von Serum experimentell mit D. viviparus infizierter Rinder nachgewiesen werden. In zwei verschiedenen Immunisierungsversuchen erfolgte an insgesamt 22 Rindern die Überprüfung des protektiven Potentials des GST-PDI-Fusionsproteins in Kombination mit den Adjuvantien Al(OH)3 und Quil A. Trotz des Vorhandenseins PDI-spezifischer Antikörper bei allen immunisierten Tieren konnte durch die Impfung kein Schutz gegen eine experimentelle Infektion vermittelt werden. Weder in der Larvenausscheidung noch in Bezug auf die Wurmbürde konnte eine statistisch signifikante Reduktion festgestellt werden. Tendenziell zeigten Tiere, die das Adjuvans Quil A erhalten hatten, eine geringere Larvenausscheidung, wobei unklar ist, ob es sich hierbei um eine spezifische Immunreaktion handelte. Weiterhin war bei allen immunisierten Tieren eine Reduktion der Wurmgröße zwischen 7,2 und 18% im Vergleich zur Kontrollgruppe zu beobachten, die jedoch ebenfalls keine statistische Signifikanz erreichte.