Phenotypic and molecular studies of the relatedness and the antimicrobial resistance of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Agona and Derby isolated from swine in Southern Brazil

Salmonellen gelten weltweit als eine der wichtigsten Ursachen für Lebensmittel bedingte bakterielle Infektionen. Vertreter der Salmonella enterica subsp. enterica (S.) Serovare Agona und Derby gehören hierbei zu den am häufigsten von Menschen, aber auch aus Probenmaterial von anderen Herkünften isolierten Serovaren, wobei S. Derby in erster Linie bei Schweinen zu finden ist. Trotz des häufigen Nachweises beider Serovare besteht ein beträchtliches Informationsdefizit hinsichtlich (a) der zur Differenzierung der Isolate im Rahmen von kurzzeit-epidemiologischen Fragestellungen am besten geeigneten Methoden und (b) der genetischen Grundlagen der antimikrobiellen Resistenz entsprechender Isolate von landwirtschaftlichen Nutztieren. In der vorliegenden Ph.D.-These wurden 45 S. Agona- und 63 S. Derby-Isolate, die von Schlachtschweinen, deren Schlachtkörpern und Schweinefleischprodukten während eines zweijährigen Zeitraumes an verschiedenen Schlachthöfen in Südbrasilien gesammelt wurden, hinsichtlich ihrer Verwandschaft und ihrer antimikrobiellen Resistenz untersucht. Basierend auf einer detaillierten Aufarbeitung der zu Beginn des Projektes verfügbaren Literatur zu phäno- und genotypischen Methoden, die bei der kurzzeit-epidemiologischen Typisierung von Salmonella-Isolaten zur Anwendung kommen [Kapitel 2], wurden Typisierungsmethoden für die Analyse der porcinen S. Agona- und S. Derby-Isolate ausgewählt. Das Methodenspektrum wurde zudem durch eine neue, erst kürzlich entwickelte Methode, Subtracted Restriction Fingerprinting (SRF), ergänzt [Kapitel 3]. Das komplexe Typisierungssystem für die S. Agona- und S. Derby-Isolate  umfasste Makrorestriktionsanalysen mit zwei Enzymen, SRF-Analyse, die Erstellung von Plasmidprofilen und die Bestimmung der antimikrobiellen Resistenzmuster. Die erst kürzlich im Robert Koch Institut in Wernigerode, Deutschland entwickelten Phagentypisierungssysteme kamen zusätzlich noch für beide Serovare zum Einsatz [Kapitel 4 und 5]. Die Makrorestriktionsanalyse mit dem Enzym BlnI erwies sich für beide Serovare als Methode mit größter Unterscheidungskraft, gefolgt von Makrorestriktionsanalyse mit XbaI und SRF-Analyse. Interessanterweise entsprachen die mittels Makrorestriktionsanalyse und SRF-Analyse definierten genomischen Hauptgruppen weitestgehend den jeweiligen Phagentypen, wobei die molekularbiologischen Verfahren selbstverständlich eine weitere Feindifferenzierung innerhalb der Isolate eines bestimmten Phagentyps ermöglichten [Kapitel 4 und 5]. Die überwiegende Mehrheit (91.1 %) der S. Agona-Isolate in der vorliegenden Studie erwies sich als empfindlich gegenüber allen getesteten 14 antimikrobiellen Wirkstoffen [Kapitel 4]. Im Gegensatz dazu zeigten 96.7 % der S. Derby-Isolate Resistenz gegenüber mindestens einem der getesteten Wirkstoffe, wobei Multiresistenz bei 71.0 % der Isolate nachweisbar war [Kapitel 5]. Alle resistenten Isolate beider Serovare waren resistent gegenüber Tetracyclin [Kapitel 4 und 5]. Eine gründliche Datenbankrecherche hinsichtlich der derzeit von Salmonella enterica-Isolaten unterschiedlicher Serovare sequenzierten und in den Datenbanken gespeicherten antimikrobiellen Resistenzgenen zeigte, dass bislang nur wenige Daten zu Resistenzgenen von S. Agona- und S. Derby-Isolaten verfügbar sind [Kapitel 6]. Alle resistenten S. Agona-Isolate aus dem vorliegenden Projekt erwiesen sich als multiresistent und verfügten über einige Resistenzgene, die auch bei anderen Salmonella-Serovaren bereits nachgewiesen wurden [Kapitel 6]. Die untersuchten porcinen Stämme unterschieden sich jedoch deutlich von den in Europa beschriebenen, SGI1-tragenden S. Agona-Ausbruchstämmen [Kapitel 7]. Weiterhin wurden neue Varianten der mit Genkassetten assoziierten Resistenzgene dfrA15b (Trimethoprimresistenz), cmlA4 (Chloramphenicolresistenz) und aadA23 (kombinierte Resistenz gegenüber Streptomycin und Spectinomycin) bei den porcinen S. Agona-Isolaten nachgewiesen. Die entsprechenden Genkassetten und Klasse 1 Integrons, aber auch die anderen bei diesen Isolaten nachgewiesenen Resistenzgene [(tet(B): kombinierte Resistenz gegenüber Tetracyclin und Minocyclin; sul1 und/oder sul2: Sulfonamidresistenz; dfrA5/dfrA14: Trimethoprimresistenz; catA1: Chloramphenicolresistenz; blaTEM: Ampicillinresistenz; strA: Streptomycinresistenz und aph(3’’)-Ia: Kanamycinresistenz)] waren auf großen konjugativen Plasmiden lokalisiert [Kapitel 8]. S. Derby-Isolate verfügten ebenfalls über die Resistenzgene sul1, sul2, tet(B) und dfrA14, aber trugen auch das Tetracyclinresistenzgen tet(A) sowie ein Klasse 1 Integron mit einer aadA2-Genkassette (kombinierte Resistenz gegenüber Streptomycin und Spectinomycin) [Kapitel 9]. Im Gegensatz zu den S. Agona-Isolaten waren die Resistenzgene und Klasse 1 Integrons bei den S. Derby-Isolaten chromosomal lokalisiert [Kapitel 5 und 9]. Die detaillierte Analyse des aadA2-Gens von S. Derby [Kapitel 9] und des aadA23-Gens von S. Agona [Kapitel 8] führten zum Nachweis von Fehlern bei der Angabe des korrekten Startkodons bei verschieden Datenbankeinträgen für verwandte aadA-Gene [Kapitel 9]. Studien zur Chinolonresistenz und zur herabgesetzten Empfindlichkeit bzw. Resistenz gegenüber Fluorchinolonen zeigte, dass keines der porcinen S. Agona- und S. Derby-Isolate Resistenz gegenüber Fluorchinolonen aufwies. Weiterhin verfügten die wenigen chinolonresistenten Isolate nicht über transferable Chinolonresistenzgene (qnr). Im Gegenatz dazu wurde das Gen qnrS erstmalig bei einem Salmonella-Isolat nachgewiesen. Das entsprechende aviäre S. Infantis-Isolat trug das qnrS-Gen zusammen mit einem Tn3-assoziierten blaTEM-Gen auf einem Plasmid. Diese Erkenntnis ist von besonderer Bedeutung, da sie belegt, dass das ursprünglich nur bei Shigella spp. nachgewiesene qnrS-Gen mittlerweile Genusgrenzen überschritten hat und nun auch bei Vertretern des Genus Salmonella zu finden ist [Kapitel 10]. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass unter Verwendung des in dieser Studie beschriebenen komplexen Typisierungssystems die Zuordnung von porcinen S. Agona- und S. Derby-Isolaten zu mehreren verschiedenen klonalen Gruppen möglich war. Aus dem Vergleich der isolatspezifischen Typisierungsdaten und den jeweiligen epidemiologischen Hintergrunddaten ließen sich Veränderungen im zeitlichen und geographischen Vorkommen von Vertretern der unterschiedlichen klonalen Gruppen von S. Agona und S. Derby dokumentieren. Die Analyse der antimikrobiellen Resistenzgene und deren Lokalisation auf mobilen genetischen Elementen erweiterte den derzeitigen Kenntnisstand über solche Gene bei Salmonella-Isolaten und lieferte wichtige Informationen in Hinblick auf den Transfer von Resistenzgenen über Spezies- und Genusgrenzen.