Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Phenotypic and molecular studies of the relatedness and the antimicrobial resistance of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Agona and Derby isolated from swine in Southern Brazil

Michael, Geovana Brenner

Salmonella is considered one of the most common causes of food-borne bacterial infections worldwide. Although S. Agona and S. Derby have been reported to be among the most common serovars isolated from human and non-human sources – with S. Derby being mainly associated with swine – there is still a considerable lack of information with regard to (a) the use of molecular typing methods for short-term epidemiological settings of S. Agona and S. Derby isolates from food animal sources and (b) the genetic basis of antimicrobial resistance in such S. Agona and S. Derby isolates. The present study dealt with both aspects by analyzing 45 S. Agona and 63 S. Derby isolates collected from slaughter age pigs, their carcasses and meat products during a 2-year period at different slaughterhouses in Southern Brazil. Based on a thorough literature review on pheno- and genotypic typing methods used for short-term epidemiology of Salmonella isolates [Chapter 2], typing methods were chosen to be applied for the porcine S. Agona and S. Derby isolates under investigation. This set of methods was supplemented by a novel typing technique, subtracted restriction fingerprinting (SRF), which has recently been developed [Chapter 3]. The complex typing system for the S. Agona and S. Derby isolates consisted of macrorestriction analysis with two different enzymes, SRF analysis, plasmid profiling, and antimicrobial susceptibility testing. In addition, phage typing systems, recently developed for both serovars at the Robert Koch Institute in Wernigerode, Germany, were also applied in this study [Chapters 4 and 5]. Macrorestriction analysis with enzyme BlnI proved to be the most discriminative method for both serovars, followed by XbaI macrorestriction analysis and SRF analysis. In general, the major clonal groups among the isolates of both serovars – as defined by macrorestriction and SRF analysis – were in full agreement with the corresponding phage types. However, macrorestriction and SRF analysis enabled a further differentiation of the isolates within a certain phage type [Chapters 4 and 5]. The vast majority (91.1 %) of the S. Agona isolates analyzed in this study was susceptible to all antimicrobial agents tested [Chapter 4]. In contrast, 96.7 % of the S. Derby isolates exhibited resistance to at least one of the antimicrobial agents tested and multiresistance was detected in 71.0 % of the isolates [Chapter 5]. All resistant isolates of both serovars were resistant to tetracycline [Chapters 4 and 5]. A thorough database search for antimicrobial resistance genes so far sequenced from Salmonella enterica isolates of various serovars showed that only a comparatively small number of resistance genes have been sequenced from S. Agona and S. Derby isolates [Chapter 6]. All resistant S. Agona isolates investigated in this project proved to be multi-resistant and revealed the presence of resistance genes commonly found in other Salmonella serovars [Chapter 6]. However, they differed distinctly from SGI1-carrying S. Agona outbreak strains described in Europe [Chapter 7]. Nevertheless, novel variants of the cassette-borne genes dfrA15b (trimethoprim resistance), cmlA4 (chloramphenicol resistance) and aadA23 (combined resistance to streptomycin and spectinomycin) were detected in the porcine S. Agona isolates. These gene cassettes, but also the other resistance genes detected [tet(B) for combined resistance to tetracycline and minocycline, sul1 and/or sul2 for sulphonamide resistance, dfrA5/dfrA14 for trimethoprim resistance, catA1 for chloramphenicol resistance, blaTEM for ampicillin resistance, strA for streptomycin resistance, and aph(3’’)-Ia for kanamycin resistance] proved to be located on a large conjugative plasmids [Chapter 8]. The S. Derby isolates harboured the resistance genes sul1, sul2, tet(B) and dfrA14, but carried also the gene tet(A) for tetracycline resistance and a class 1 integron with an aadA2 gene cassette for combined resistance to streptomycin and spectinomycin [Chapter 9]. In contrast to the situation in S. Agona, the resistance genes and class 1 integrons found in S. Derby were all located in the chromosomal DNA [Chapters 5 and 9]. The detailed analysis of the aadA2 gene from S. Derby [Chapter 9] and the aadA23 gene from S. Agona [Chapter 8] also identified mistakes in the annotation of various similar aadA genes deposited in the databases [Chapter 9]. Studies on quinolone resistance and decreased susceptibility/resistance to fluoroquinolones revealed that the none of the S. Agona and S. Derby isolates were resistant to fluoroquinolones and that the few quinolone resistant isolates did not harbour qnr genes for transferable quinolone resistance. In contrast, the gene qnrS was identified for the first time in Salmonella. The corresponding avian S. Infantis isolate carried the qnrS gene together with a Tn3-borne blaTEM gene on a plasmid. This finding was of particular relevance since it showed that this type of qnr gene – which has been detected initially only in Shigella spp. – has meanwhile crossed genus borders and reached the genus Salmonella [Chapter 10]. In conclusion, the use of a complex typing system for S. Agona and S. Derby isolates enabled the assignment of the various isolates to several different clonal groups. When putting the isolate-specific data in context with epidemiological background data, changes in the temporal and geographical distribution of members of the different clonal groups of S. Agona and S. Derby became obvious. In addition, the analysis of the antimicrobial resistance genes and their location on mobile genetic elements extended the current knowledge of such genes in Salmonella and also provided important information with regard to the horizontal transfer of resistance genes across species and genus borders.

Salmonellen gelten weltweit als eine der wichtigsten Ursachen für Lebensmittel bedingte bakterielle Infektionen. Vertreter der Salmonella enterica subsp. enterica (S.) Serovare Agona und Derby gehören hierbei zu den am häufigsten von Menschen, aber auch aus Probenmaterial von anderen Herkünften isolierten Serovaren, wobei S. Derby in erster Linie bei Schweinen zu finden ist. Trotz des häufigen Nachweises beider Serovare besteht ein beträchtliches Informationsdefizit hinsichtlich (a) der zur Differenzierung der Isolate im Rahmen von kurzzeit-epidemiologischen Fragestellungen am besten geeigneten Methoden und (b) der genetischen Grundlagen der antimikrobiellen Resistenz entsprechender Isolate von landwirtschaftlichen Nutztieren. In der vorliegenden Ph.D.-These wurden 45 S. Agona- und 63 S. Derby-Isolate, die von Schlachtschweinen, deren Schlachtkörpern und Schweinefleischprodukten während eines zweijährigen Zeitraumes an verschiedenen Schlachthöfen in Südbrasilien gesammelt wurden, hinsichtlich ihrer Verwandschaft und ihrer antimikrobiellen Resistenz untersucht. Basierend auf einer detaillierten Aufarbeitung der zu Beginn des Projektes verfügbaren Literatur zu phäno- und genotypischen Methoden, die bei der kurzzeit-epidemiologischen Typisierung von Salmonella-Isolaten zur Anwendung kommen [Kapitel 2], wurden Typisierungsmethoden für die Analyse der porcinen S. Agona- und S. Derby-Isolate ausgewählt. Das Methodenspektrum wurde zudem durch eine neue, erst kürzlich entwickelte Methode, Subtracted Restriction Fingerprinting (SRF), ergänzt [Kapitel 3]. Das komplexe Typisierungssystem für die S. Agona- und S. Derby-Isolate  umfasste Makrorestriktionsanalysen mit zwei Enzymen, SRF-Analyse, die Erstellung von Plasmidprofilen und die Bestimmung der antimikrobiellen Resistenzmuster. Die erst kürzlich im Robert Koch Institut in Wernigerode, Deutschland entwickelten Phagentypisierungssysteme kamen zusätzlich noch für beide Serovare zum Einsatz [Kapitel 4 und 5]. Die Makrorestriktionsanalyse mit dem Enzym BlnI erwies sich für beide Serovare als Methode mit größter Unterscheidungskraft, gefolgt von Makrorestriktionsanalyse mit XbaI und SRF-Analyse. Interessanterweise entsprachen die mittels Makrorestriktionsanalyse und SRF-Analyse definierten genomischen Hauptgruppen weitestgehend den jeweiligen Phagentypen, wobei die molekularbiologischen Verfahren selbstverständlich eine weitere Feindifferenzierung innerhalb der Isolate eines bestimmten Phagentyps ermöglichten [Kapitel 4 und 5]. Die überwiegende Mehrheit (91.1 %) der S. Agona-Isolate in der vorliegenden Studie erwies sich als empfindlich gegenüber allen getesteten 14 antimikrobiellen Wirkstoffen [Kapitel 4]. Im Gegensatz dazu zeigten 96.7 % der S. Derby-Isolate Resistenz gegenüber mindestens einem der getesteten Wirkstoffe, wobei Multiresistenz bei 71.0 % der Isolate nachweisbar war [Kapitel 5]. Alle resistenten Isolate beider Serovare waren resistent gegenüber Tetracyclin [Kapitel 4 und 5]. Eine gründliche Datenbankrecherche hinsichtlich der derzeit von Salmonella enterica-Isolaten unterschiedlicher Serovare sequenzierten und in den Datenbanken gespeicherten antimikrobiellen Resistenzgenen zeigte, dass bislang nur wenige Daten zu Resistenzgenen von S. Agona- und S. Derby-Isolaten verfügbar sind [Kapitel 6]. Alle resistenten S. Agona-Isolate aus dem vorliegenden Projekt erwiesen sich als multiresistent und verfügten über einige Resistenzgene, die auch bei anderen Salmonella-Serovaren bereits nachgewiesen wurden [Kapitel 6]. Die untersuchten porcinen Stämme unterschieden sich jedoch deutlich von den in Europa beschriebenen, SGI1-tragenden S. Agona-Ausbruchstämmen [Kapitel 7]. Weiterhin wurden neue Varianten der mit Genkassetten assoziierten Resistenzgene dfrA15b (Trimethoprimresistenz), cmlA4 (Chloramphenicolresistenz) und aadA23 (kombinierte Resistenz gegenüber Streptomycin und Spectinomycin) bei den porcinen S. Agona-Isolaten nachgewiesen. Die entsprechenden Genkassetten und Klasse 1 Integrons, aber auch die anderen bei diesen Isolaten nachgewiesenen Resistenzgene [(tet(B): kombinierte Resistenz gegenüber Tetracyclin und Minocyclin; sul1 und/oder sul2: Sulfonamidresistenz; dfrA5/dfrA14: Trimethoprimresistenz; catA1: Chloramphenicolresistenz; blaTEM: Ampicillinresistenz; strA: Streptomycinresistenz und aph(3’’)-Ia: Kanamycinresistenz)] waren auf großen konjugativen Plasmiden lokalisiert [Kapitel 8]. S. Derby-Isolate verfügten ebenfalls über die Resistenzgene sul1, sul2, tet(B) und dfrA14, aber trugen auch das Tetracyclinresistenzgen tet(A) sowie ein Klasse 1 Integron mit einer aadA2-Genkassette (kombinierte Resistenz gegenüber Streptomycin und Spectinomycin) [Kapitel 9]. Im Gegensatz zu den S. Agona-Isolaten waren die Resistenzgene und Klasse 1 Integrons bei den S. Derby-Isolaten chromosomal lokalisiert [Kapitel 5 und 9]. Die detaillierte Analyse des aadA2-Gens von S. Derby [Kapitel 9] und des aadA23-Gens von S. Agona [Kapitel 8] führten zum Nachweis von Fehlern bei der Angabe des korrekten Startkodons bei verschieden Datenbankeinträgen für verwandte aadA-Gene [Kapitel 9]. Studien zur Chinolonresistenz und zur herabgesetzten Empfindlichkeit bzw. Resistenz gegenüber Fluorchinolonen zeigte, dass keines der porcinen S. Agona- und S. Derby-Isolate Resistenz gegenüber Fluorchinolonen aufwies. Weiterhin verfügten die wenigen chinolonresistenten Isolate nicht über transferable Chinolonresistenzgene (qnr). Im Gegenatz dazu wurde das Gen qnrS erstmalig bei einem Salmonella-Isolat nachgewiesen. Das entsprechende aviäre S. Infantis-Isolat trug das qnrS-Gen zusammen mit einem Tn3-assoziierten blaTEM-Gen auf einem Plasmid. Diese Erkenntnis ist von besonderer Bedeutung, da sie belegt, dass das ursprünglich nur bei Shigella spp. nachgewiesene qnrS-Gen mittlerweile Genusgrenzen überschritten hat und nun auch bei Vertretern des Genus Salmonella zu finden ist [Kapitel 10]. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass unter Verwendung des in dieser Studie beschriebenen komplexen Typisierungssystems die Zuordnung von porcinen S. Agona- und S. Derby-Isolaten zu mehreren verschiedenen klonalen Gruppen möglich war. Aus dem Vergleich der isolatspezifischen Typisierungsdaten und den jeweiligen epidemiologischen Hintergrunddaten ließen sich Veränderungen im zeitlichen und geographischen Vorkommen von Vertretern der unterschiedlichen klonalen Gruppen von S. Agona und S. Derby dokumentieren. Die Analyse der antimikrobiellen Resistenzgene und deren Lokalisation auf mobilen genetischen Elementen erweiterte den derzeitigen Kenntnisstand über solche Gene bei Salmonella-Isolaten und lieferte wichtige Informationen in Hinblick auf den Transfer von Resistenzgenen über Spezies- und Genusgrenzen.

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Michael, Geovana Brenner: Phenotypic and molecular studies of the relatedness and the antimicrobial resistance of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Agona and Derby isolated from swine in Southern Brazil. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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