Expansion, differentiation and transfection of ventral mesencephalic progenitor cells

Neuronale Vorläufer-Zellen, spielen als Bestandteil zellulärer Transplantate eine wichtige Rolle in mögliche regenerativen Therapieansätzen für neurodegenerative Erkrankungen, wie z. B. dem Morbus Parkinson (PD).  Drei Hauptprobleme konnten allerdings bisher nicht gelöst werden: (i) das Auftreten schwerer Dyskinesien bei mit Zellen behandelten Patienten in doppelt verblindeten klinischen Studien, (ii) das geringe Überleben transplantierter Zellen, (iii) die Identifikation transplantierter allogener Zellen in vivo. Zur Lösung der Probleme (ii) und (iii), wurden in dieser Arbeit Möglichkeiten zur Transfektion mesencephaler neuronaler Vorläufer-Zellen mit unterschiedlichen Konstrukten aus Wachstumsfaktor-Genen wie dem Fibroblastenwachstums-Faktor-2-Gen und Reporter-Protein-Genen wie dem EGFP-Gen (zur Induktion grüner Fluoreszenz) und dem DsRed-Gen (zur Induktion roter Fluoreszenz) untersucht. Verschiedene Transfektionsmethoden wurden zunächst getestet: Lipofection mit dem Lipofectamine 2000 Reagenz (bezogen bei Invitrogen), Elektroporation mit dem EasyJecT Optima Elektroporator (bezogen bei EquiBio Ltd)  und Nucleofection mit dem Nucleofector-Gerät (von der Amaxa GmbH). Vorläufer-Zellen aus dem ventralen Mesencephalon (VMP) wurden aus 12 Tage alten Ratten-Embryonen gewonnen und vor der Transfektion über drei Tage in Zellkultur expandiert. Die höchste Transfektionsrate von bis zu 47 % konnte mit der Nucleofector-Technik erzielt werden.  Die Überlebensrate der transfizierten Zellen betrug sechs Stunden nach der Transfektion etwa 40 %. Darüber hinaus  differenzierten die überlebenden transfizierten VMP-Zellen in Tyrosin-Hydroxylase positive (TH+) Neurone.  Die Population der transfizierten Zellen bestand aus vielen neuronalen Vorläufer-Zellen (nestin+, Glial Fibrillary Acidic Protein negativ (GFAP-)), einschließlich einiger Neurone (ßIII-tubulin+). Um die Vorläufer-Zellen mit ihrem eigenen Wachstumsfaktor versorgen zu können, wurde die erhöhte Expression der 18 kDa FGF-2-Isoform in den Zellen induziert.  Funktionelle Test, wie ein Zell-Vitalitäts-Essay (WST-1 test) und ein Zell-Proliferations-Essay (BrdU-ELISA), wurden durchgeführt, um das Verhalten der transfizierten Zellen  in vitro zu beurteilen. Die Expression der in die Zellen verbrachten Gene war während der ersten Tag nach der Transfektion am höchsten, so zeigten transfizierte VMP-Zellen eine 4-fach erhöhte Expression von FGF-2.  Überraschend zeigte sich ein vermindertes Überleben und eine reduzierte Proliferationsrate in der selben Gruppe, beide erreichten in der Differenzierungsphase das Niveau nicht-transfizierter Zellen.  Nach Transplantation von mit Nuclefection veränderten VMP-Zellen in das Striatum von Ratten im PD-Model, konnten die Zellen aufgrund der in ihnen induzierten Expression von EGFP detektiert werden.  Die immunhistochemische Analyse von Gewebeschnitten belegte, dass mit Nucleofection veränderte VMP-Zellen ihr Potential zur Differenzierung in TH+ Zellen nach Nucleofection beibehielten. Die vorgestellte Arbeit zeigt, dass Nucleofection die effektivste nicht-virale Methode ist, Gene in primäre VMP-Zellen zu verbringen, diese Zellen sind die wichtigste Quelle dopaminerger Neurone in Zell-Ersatz-Strategien bei PD.  Die Nucleofector-Technik erlaubt die Transfektion neuronaler Vorläufer-Zellen mit hoher Effizienz ohne die Zusammensetzung der Zellpopulation oder deren Differenzierungspotential zu verändern.  Die Technik kann auch dazu verwendet werden, Wachstumsfaktor-Gene effizient in die Zellen zu verbringen, was wiederum die Manipulation der Zelleigenschaften in vitro ermöglicht.  Diese effiziente nicht-virale Transfektionsmethode kann die mit viraler Transfektion verbundenen Risiken reduzieren, wie z.B. starke entzündliche Immunantwort, mögliche Interferenz in der Protein-Prozessierung und verändertes Proteinbindungsverhalten.  Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit können zur Optimierung derzeitiger Transplantations-Strategien beitragen, dadurch dass mit der vorgestellten Technik primäre neuronale Zellen und neuronale Stamm-Zellen vor der therapeutischen Applikation bei neurodegenerativen Erkrankungen beeinflusst werden können.