Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Detection and organisation of antimicrobial resistance genes in Bordetella bronchiseptica isolates from pigs

Kadlec, Kristina

Bordetella bronchiseptica is a Gram-negative respiratory tract pathogen. In pigs, it causes various symptoms ranging from mild rhinitis to severe pneumonia. Moreover, B. bronchiseptica infections predispose pigs to infections with other pathogens, e.g. toxigenic Pasteurella multocida. Antimicrobial agents are frequently used to control respiratory tract infections in swine production. In contrast to other well-studied respiratory tact pathogens, little is known about antimicrobial resistance and resistance genes in B. bronchiseptica. The aims of this study were to 1) provide an overview on antimicrobial resistance of German B. bronchiseptica isolates from pigs, 2) detect genes that confer resistance to selected antimicrobial agents in B. bronchiseptica, and 3) identify their localization on mobile genetic elements and their transferability. In the first part of the study 349 B. bronchiseptica isolates, which had been collected from pigs with respiratory tract disease between 2000 and 2003, were investigated for their susceptibility to 15 antimicrobial agents or combinations of agents by microdilution according to CLSI recommendations [chapter 2]. Interpretation of these results was hampered by the lack of breakpoints for a classification of the minimum inhibitory concentrations (MICs) into one of the three categories “susceptible”, “intermediate” or “resistant”. Such approved B. bronchiseptica-specific breakpoints are currently available only for a single antimicrobial agent, namely florfenicol. For florfenicol, 2.9% of the isolates were resistant and 17.5% were classified as intermediately susceptible. The B. bronchiseptica isolates differed in their antimicrobial susceptibility from other porcine respiratory tract pathogens, such as Pasteurella multocida or Actinobacillus pleuropneumoniae. For the following parts of the study, isolates were chosen for further investigations on the basis of their MICs [chapters 3-6]. Six isolates showed high MICs to trimethoprim and genes coding for trimethoprim-resistant dihydrofolate reductases (dfr genes) were identified [chapter 3]. These genes were located on gene cassettes. In all six isolates, a class 1 integron harboured the dfr cassette in combination with a catB cassette coding for a type B chloramphenicol acetyltransferase, which confers resistance to chloramphenicol, but not to florfenicol. In one isolate, a dfrB1 cassette and a catB2 cassette were sequenced. The remaining five genetically related isolates carried the resistance gene cassettes dfrA1 and catB3. Both types of class 1 integrons were located on conjugative plasmids. In two tetracycline-resistant isolates, the tetracycline resistance gene tet(A) coding for a tetracycline exporter was identified on two different conjugative or non-conjugative plasmids [chapter 4]. The resistance gene tet(A) and its repressor gene tetR were part of truncated transposon Tn1721 relics in both cases. The conjugative plasmid harboured also the dfrB1 - catB2 integron and sequencing of the regions flanking region the tetR-tet(A) part identified a stretch of 3445 bp, which were homologous to Tn1721. The non-conjugative tetracycline resistance plasmid showed homology to Tn1721 for 5490 bp. From this latter plasmid, an EcoRI self-ligand was produced, sequenced completely and a new gene for plasmid replication was identified. The encoded replication protein (Rep) showed 72.2% and 63.8% homology to Rep proteins from Nitrosomonas eutropha and Pseudomonas aeruginosa, respectively. According to the CLSI-approved breakpoints, ten of the 349 B. bronchiseptica isolates were classified as florfenicol-resistant. In addition, seven porcine florfenicol-resistant isolates collected in 2004-2006 and one feline florfenicol-resistant isolate from 2005 were included [chapter 5]. Nine of the 18 florfenicol-resistant isolates carried the gene floR in the chromosomal DNA. This gene codes for an efflux protein of the major facilitator (MF) superfamily and confers resistance to chloramphenicol and florfenicol. The isolates carrying floR were plasmid-free and showed similar macrorestriction patterns. The remaining nine florfenicol/chloramphenicol-resistant but floR-negative isolates showed distinctly decreased MICs to florfenicol and chloramphenicol, when exposed to the efflux pump inhibitor Phe-Arg-b-naphthylamide, concluding that a not further specified efflux mechanism is responsible for florfenicol/chloramphenicol resistance in these isolates [chapter 5]. Moreover, a novel gene, cmlB1, coding for a chloramphenicol exporter of the MF superfamily, was detected in an isolate with a high MIC for chloramphenicol of 128 mg/L [chapter 5]. The gene cmlB1 was located on a conjugative 50 kb plasmid. The corresponding gene product showed 73.8-76.5% homology to the known CmlA proteins. In contrast to most of the sequenced cmlA variants, the gene cmlB1 was not located on a gene cassette. The B. bronchiseptica isolates from this study showed a low susceptibility to β-lactams. For the detection of β-lactam resistance genes, 19 isolates with high MICs to ampicillin were used [chapter 6]. In nine isolates with ampicillin MICs of 64 and 128 mg/L, the β-lactamase gene blaOXA-2 was identified. This gene was located on a gene cassette in a class 1 integron. The gene blaOXA-2 was detected in eight of the isolates on a 50 kb conjugative plasmid, which conferred ampicillin resistance in E. coli hosts, and in the chromosomal DNA in the ninth isolate. The nine blaOXA-2-positive isolates showed related macrorestriction pattern, whereas other isolates with high ampicillin MICs differed in their patterns. The species-specific β-lactamase from B. bronchiseptica BOR-1, which also mediates ampicillin resistance in E. coli, was detected in B. bronchiseptica isolates with different ampicillin MICs. No further β-lactamases could be detected by isoelectric focusing or SDS-PAGE. Susceptibility testing in the presence of efflux inhibitors revealed, that efflux mechanisms are not involved in β-lactam resistance. Studies on the membrane permeability of a selected B. bronchiseptica isolate showed, that the cephalosporins cefoxitin and cephalothin are not able to efficiently enter the cell. Thus, a low membrane permeability may also account for the low susceptibility of B. bronchiseptica to β-lactam antibiotics.   In porcine B. bronchiseptica isolates the resistance genes identified differ distinctly from those detected in other respiratory tract pathogens of pigs, such as P. multocida. The majority of genes was located on mobile genetic elements. Class 1 integrons, which are common in Enterobacteriaceae but not in Pasteurellaceae, were detected. Plasmid-borne genes could be transferred to E. coli recipient strains and conferred the expected resistance properties in these bacteria. This observation points towards an exchange of resistance genes between Enterobacteriaceae and B. bronchiseptica. 

Bordetella bronchiseptica ist ein Gram-negativer Krankheitserreger des Respirationstraktes. Beim Schwein reichen die Symptome von milder Rhinitis bis zu schwerer Pneumonie und B. bronchiseptica ist ein Wegbereiter für die Infektion mit anderen Pathogenen, z.B. toxigenen Pasteurella multocida-Stämmen. Antimikrobielle Wirkstoffe werden in der Schweineproduktion regelmäßig verwendet, um Infektionen des Respirationstraktes zu behandeln. Während Resistenzmechanismen für andere Erreger des Respirationstraktes beschrieben sind, ist über antimikrobielle Resistenz und Resistenzgene von B. bronchiseptica sehr wenig bekannt. Die Ziele der vorliegenden Studie waren, 1) einen Überblick über die Resistenzlage von porcinen B. bronchiseptica-Isolaten aus Deutschland zu geben, 2) Gene, die Resistenz gegenüber ausgewählten antimikrobiellen Wirkstoffen vermitteln bei B. bronchiseptica zu identifizieren und 3) deren Lokalisation auf mobilen genetischen Elementen und Übertragbarkeit nachzuweisen. Im ersten Teil der Studie wurden 349 B. bronchiseptica-Isolate von Schweinen mit respiratorischen Erkrankungen mittels Bouillon-Mikrodilution gemäß den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) auf ihre Empfindlichkeit gegenüber 15 antimikrobiellen Wirkstoffen oder Kombinationen von Wirkstoffen untersucht [Kapitel 2]. Die Interpretation der Ergebnisse wurde erschwert, da Grenzwerte für die Klassifizierung von B. bronchiseptica-Isolaten anhand der Minimalen Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) in eine der drei Kategorien „empfindlich“, „intermediär“ oder „resistent“ weitgehend fehlen. Bisher sind B. bronchiseptica-spezifische Grenzwerte nur für den Wirkstoff Florfenicol festgelegt. 2,9% der Isolate waren florfenicolresistent und 17,5% intermediär empfindlich. Die B. bronchiseptica Isolate unterschieden sich hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit von anderen porcinen Erregern des Respirationstraktes, wie Pasteurella multocida oder Actinobacillus pleuropneumoniae. Für die weiteren Untersuchungen hinsichtlich der molekularen Grundlagen der antimikrobiellen Resistenz wurden Isolate auf der Basis der MHK-Werte ausgewählt [Kapitel 3-6]. Sechs Isolate zeigten hohe MHK-Werte für Trimethoprim und Gene (dfr Gene), die für resistenzvermittelnde Dihydrofolat-Reduktasen kodieren, wurden identifiziert [Kapitel 3]. Diese Gene waren auf Genkassetten lokalisiert. In allen sechs Isolaten wurde die jeweilige dfr-Genkassette in einem Klasse 1-Integron in Kombination mit einer catB-Genkassette identifiziert. Die catB-Gene kodieren für Typ B Chloramphenicol-Acetyltransferasen, welche Chloramphenicolresistenz vermitteln. In einem der Isolate wurden eine dfrB1-Kassette und eine catB2-Kassette sequenziert. Die anderen fünf Isolate waren genetisch verwandt und verfügten über dfrA1- und catB3-Kassetten. Die beiden unterschiedlichen Typen von Klasse 1-Integrons waren auf konjugativen Plasmiden lokalisiert. In zwei tetrazyklinresistenten Isolaten wurde das Tetrazyklin-Resistenzgen tet(A) auf zwei unterschiedlichen, konjugativen bzw. nicht-konjugativen Plasmiden, identifiziert [Kapitel 4]. In beiden Fällen waren das Resistenzgen tet(A) und das Gen für den zugehörigen Repressor tetR auf einem partiell deletierten Transposon Tn1721 lokalisiert. Auf dem konjugati-ven Plasmid befand sich auch das Integron mit den dfrB1- und catB2-Kassetten. Die Sequenzierung der die tetR-tet(A)-Region flankierenden Bereiche ergab einen zu Tn1721 homologen Bereich von 3445 bp. Das nicht-konjugative Plasmid zeigte Homologie zu Tn1721 über 5490 bp. Von diesem Plasmid wurde ein EcoRI Selbstligand erstellt und vollständig sequenziert. Ein neues Gens, das für die Plasmidreplikation verantwortlich ist, wurde nachgewiesen. Das entsprechende Replikationsprotein (Rep) zeigte 72,2% bzw. 63,8% Homologie zu Rep-Proteinen von Nitrosomonas eutropha bzw. Pseudomonas aeruginosa. Gemäß den vom CLSI festgelegten Grenzwerten wurden von den 349 B. bronchiseptica-Isolaten zehn als florfenicolresistent klassifiziert. In diesen Teil der Studie wurden zusätzlich sieben porcine florfenicolresistente Isolate aus den Jahren 2004-2006 und ein felines florfenicolresistentes Isolat aus dem Jahr 2005 eingeschlossen [Kapitel 5]. Neun der insgesamt 18 florfenicolresistenten Isolate verfügten über ein chromosomal lokalisiertes floR-Gen. Dieses Gen kodiert für ein Effluxprotein aus der “Major Facilitator Superfamily” (MFS) and vermittelt Resistenz gegenüber Florfenicol und Chloramphenicol. Die floR-tragenden Isolate hatten keine Plasmide und zeigten verwandte Makrorestriktionsmuster. Die übrigen neun florfenicol-/chloramphenicolresistenten Isolate, die floR-negativ waren, zeigten deutlich reduzierte MHK-Werte gegenüber Florfenicol und Chloramphenicol in Gegenwart des Effluxinhibitors Phe-Arg-β-Naphthylamid [Kapitel 5]. Diese Inhibition deutete darauf hin, dass wahrscheinlich in diesen Isolaten ein noch nicht weiter spezifizierter Effluxmechanismus für Florfenicol-/Chloramphenicolresistenz verantwortlich ist. Ferner wurde in einem Isolat mit einem hohen MHK für Chloramphenicol von 128 mg/L ein neues Gen, cmlB1, identifiziert [Kapitel 5]. Es kodiert für einen Chloramphenicolexporter vom MFS-Typ. Das Gen cmlB1 war auf einem konjugativen Plasmid von ca. 50 kb lokalisiert. Das entsprechende CmlB1-Protein zeigte 73,8-76,5% Homologie zu den bislang bekannten CmlA-Proteinen. Im Gegensatz zu den meisten der sequenzierten cmlA-Varianten, war das Gen cmlB1 nicht auf einer Genkassette lokalisiert. Die B. bronchiseptica-Isolate dieser Studie wiesen geringe Empfindlichkeit gegenüber β-Laktamen auf. Für die Detektion von Resistenzgenen wurden 19 Isolate mit hohen MHK-Werten gegenüber Ampicillin verwendet [Kapitel 6]. In neun Isolaten mit Ampicillin MHK-Werten von 64 und 128 mg/L wurde das β-Laktamase Gen blaOXA-2 identifiziert. Dieses Gen war auf einer Genkassette in einem Klasse 1-Integron lokalisiert. Dieses Integron lag bei acht Isolaten auf einem konjugativen Plasmid von ca. 50 kb, welches Ampicillinresistenz in E. coli-Empfängerstämmen vermittelte, und bei dem neunten Isolat in der chromosomalen DNA. Die neun blaOXA-2-positiven Isolate waren genetisch verwandt, während die übrigen zehn Isolate sich in ihren Makrorestriktionsmustern unterschieden. Die spezies-spezifische β-Lakta-mase von B. bronchiseptica, BOR-1, die ebenfalls Ampicillinresistenz in E. coli vermittelt, zeigte keine Sequenzunterschiede in B. bronchiseptica-Isolaten mit verschiedenen MHK-Werten für Ampicillin. Es konnten keine weiteren β-Laktamasen mittels isoelektrischer Fokussierung oder SDS-PAGE detektiert werden. Die Empfindlichkeitsprüfung in Anwesenheit von Effluxinhibitoren zeigte, dass Efflux-Mechanismen nicht an der β-Laktamresistenz der untersuchten B. bronchiseptica-Isolate beteiligt sind. Studien zur Membranpermeabilität eines ausgewählten Isolates zeigten, dass die Cephalosporine Cefoxitin und Cephalothin nicht in ausreichendem Maße in die Zelle gelangen. Niedrige Membranpermeabilität könnte demnach zur geringen Empfindlichkeit von B. bronchiseptica gegenüber β-Laktamen beitragen. Die Resistenzgene, die in porcinen B. bronchiseptica-Isolaten identifiziert wurden, unterschieden sich deutlich von denen anderer Erreger respiratorischer Erkrankungen, wie P. multocida. Ein Großteil der Gene war auf mobilen genetischen Elementen lokalisiert. Klasse 1 Integrons, die häufig in Enterobacteriaceae aber nicht in Pasteurellaeae vorkommen, wurden nachgewiesen. Plasmid-lokalisierte Gene konnten in E. coli übertragen werden und vermittelten die erwarteten Resistenzeigenschaften auch in diesen Bakterien, was auf einen Austausch von Resistenzgenen zwischen Enterobacteriaceae und B. bronchiseptica hindeutet. 

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Kadlec, Kristina: Detection and organisation of antimicrobial resistance genes in Bordetella bronchiseptica isolates from pigs. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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