Detection and organisation of antimicrobial resistance genes in Bordetella bronchiseptica isolates from pigs

Bordetella bronchiseptica ist ein Gram-negativer Krankheitserreger des Respirationstraktes. Beim Schwein reichen die Symptome von milder Rhinitis bis zu schwerer Pneumonie und B. bronchiseptica ist ein Wegbereiter für die Infektion mit anderen Pathogenen, z.B. toxigenen Pasteurella multocida-Stämmen. Antimikrobielle Wirkstoffe werden in der Schweineproduktion regelmäßig verwendet, um Infektionen des Respirationstraktes zu behandeln. Während Resistenzmechanismen für andere Erreger des Respirationstraktes beschrieben sind, ist über antimikrobielle Resistenz und Resistenzgene von B. bronchiseptica sehr wenig bekannt. Die Ziele der vorliegenden Studie waren, 1) einen Überblick über die Resistenzlage von porcinen B. bronchiseptica-Isolaten aus Deutschland zu geben, 2) Gene, die Resistenz gegenüber ausgewählten antimikrobiellen Wirkstoffen vermitteln bei B. bronchiseptica zu identifizieren und 3) deren Lokalisation auf mobilen genetischen Elementen und Übertragbarkeit nachzuweisen. Im ersten Teil der Studie wurden 349 B. bronchiseptica-Isolate von Schweinen mit respiratorischen Erkrankungen mittels Bouillon-Mikrodilution gemäß den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) auf ihre Empfindlichkeit gegenüber 15 antimikrobiellen Wirkstoffen oder Kombinationen von Wirkstoffen untersucht [Kapitel 2]. Die Interpretation der Ergebnisse wurde erschwert, da Grenzwerte für die Klassifizierung von B. bronchiseptica-Isolaten anhand der Minimalen Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) in eine der drei Kategorien „empfindlich“, „intermediär“ oder „resistent“ weitgehend fehlen. Bisher sind B. bronchiseptica-spezifische Grenzwerte nur für den Wirkstoff Florfenicol festgelegt. 2,9% der Isolate waren florfenicolresistent und 17,5% intermediär empfindlich. Die B. bronchiseptica Isolate unterschieden sich hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit von anderen porcinen Erregern des Respirationstraktes, wie Pasteurella multocida oder Actinobacillus pleuropneumoniae. Für die weiteren Untersuchungen hinsichtlich der molekularen Grundlagen der antimikrobiellen Resistenz wurden Isolate auf der Basis der MHK-Werte ausgewählt [Kapitel 3-6]. Sechs Isolate zeigten hohe MHK-Werte für Trimethoprim und Gene (dfr Gene), die für resistenzvermittelnde Dihydrofolat-Reduktasen kodieren, wurden identifiziert [Kapitel 3]. Diese Gene waren auf Genkassetten lokalisiert. In allen sechs Isolaten wurde die jeweilige dfr-Genkassette in einem Klasse 1-Integron in Kombination mit einer catB-Genkassette identifiziert. Die catB-Gene kodieren für Typ B Chloramphenicol-Acetyltransferasen, welche Chloramphenicolresistenz vermitteln. In einem der Isolate wurden eine dfrB1-Kassette und eine catB2-Kassette sequenziert. Die anderen fünf Isolate waren genetisch verwandt und verfügten über dfrA1- und catB3-Kassetten. Die beiden unterschiedlichen Typen von Klasse 1-Integrons waren auf konjugativen Plasmiden lokalisiert. In zwei tetrazyklinresistenten Isolaten wurde das Tetrazyklin-Resistenzgen tet(A) auf zwei unterschiedlichen, konjugativen bzw. nicht-konjugativen Plasmiden, identifiziert [Kapitel 4]. In beiden Fällen waren das Resistenzgen tet(A) und das Gen für den zugehörigen Repressor tetR auf einem partiell deletierten Transposon Tn1721 lokalisiert. Auf dem konjugati-ven Plasmid befand sich auch das Integron mit den dfrB1- und catB2-Kassetten. Die Sequenzierung der die tetR-tet(A)-Region flankierenden Bereiche ergab einen zu Tn1721 homologen Bereich von 3445 bp. Das nicht-konjugative Plasmid zeigte Homologie zu Tn1721 über 5490 bp. Von diesem Plasmid wurde ein EcoRI Selbstligand erstellt und vollständig sequenziert. Ein neues Gens, das für die Plasmidreplikation verantwortlich ist, wurde nachgewiesen. Das entsprechende Replikationsprotein (Rep) zeigte 72,2% bzw. 63,8% Homologie zu Rep-Proteinen von Nitrosomonas eutropha bzw. Pseudomonas aeruginosa. Gemäß den vom CLSI festgelegten Grenzwerten wurden von den 349 B. bronchiseptica-Isolaten zehn als florfenicolresistent klassifiziert. In diesen Teil der Studie wurden zusätzlich sieben porcine florfenicolresistente Isolate aus den Jahren 2004-2006 und ein felines florfenicolresistentes Isolat aus dem Jahr 2005 eingeschlossen [Kapitel 5]. Neun der insgesamt 18 florfenicolresistenten Isolate verfügten über ein chromosomal lokalisiertes floR-Gen. Dieses Gen kodiert für ein Effluxprotein aus der “Major Facilitator Superfamily” (MFS) and vermittelt Resistenz gegenüber Florfenicol und Chloramphenicol. Die floR-tragenden Isolate hatten keine Plasmide und zeigten verwandte Makrorestriktionsmuster. Die übrigen neun florfenicol-/chloramphenicolresistenten Isolate, die floR-negativ waren, zeigten deutlich reduzierte MHK-Werte gegenüber Florfenicol und Chloramphenicol in Gegenwart des Effluxinhibitors Phe-Arg-β-Naphthylamid [Kapitel 5]. Diese Inhibition deutete darauf hin, dass wahrscheinlich in diesen Isolaten ein noch nicht weiter spezifizierter Effluxmechanismus für Florfenicol-/Chloramphenicolresistenz verantwortlich ist. Ferner wurde in einem Isolat mit einem hohen MHK für Chloramphenicol von 128 mg/L ein neues Gen, cmlB1, identifiziert [Kapitel 5]. Es kodiert für einen Chloramphenicolexporter vom MFS-Typ. Das Gen cmlB1 war auf einem konjugativen Plasmid von ca. 50 kb lokalisiert. Das entsprechende CmlB1-Protein zeigte 73,8-76,5% Homologie zu den bislang bekannten CmlA-Proteinen. Im Gegensatz zu den meisten der sequenzierten cmlA-Varianten, war das Gen cmlB1 nicht auf einer Genkassette lokalisiert. Die B. bronchiseptica-Isolate dieser Studie wiesen geringe Empfindlichkeit gegenüber β-Laktamen auf. Für die Detektion von Resistenzgenen wurden 19 Isolate mit hohen MHK-Werten gegenüber Ampicillin verwendet [Kapitel 6]. In neun Isolaten mit Ampicillin MHK-Werten von 64 und 128 mg/L wurde das β-Laktamase Gen blaOXA-2 identifiziert. Dieses Gen war auf einer Genkassette in einem Klasse 1-Integron lokalisiert. Dieses Integron lag bei acht Isolaten auf einem konjugativen Plasmid von ca. 50 kb, welches Ampicillinresistenz in E. coli-Empfängerstämmen vermittelte, und bei dem neunten Isolat in der chromosomalen DNA. Die neun blaOXA-2-positiven Isolate waren genetisch verwandt, während die übrigen zehn Isolate sich in ihren Makrorestriktionsmustern unterschieden. Die spezies-spezifische β-Lakta-mase von B. bronchiseptica, BOR-1, die ebenfalls Ampicillinresistenz in E. coli vermittelt, zeigte keine Sequenzunterschiede in B. bronchiseptica-Isolaten mit verschiedenen MHK-Werten für Ampicillin. Es konnten keine weiteren β-Laktamasen mittels isoelektrischer Fokussierung oder SDS-PAGE detektiert werden. Die Empfindlichkeitsprüfung in Anwesenheit von Effluxinhibitoren zeigte, dass Efflux-Mechanismen nicht an der β-Laktamresistenz der untersuchten B. bronchiseptica-Isolate beteiligt sind. Studien zur Membranpermeabilität eines ausgewählten Isolates zeigten, dass die Cephalosporine Cefoxitin und Cephalothin nicht in ausreichendem Maße in die Zelle gelangen. Niedrige Membranpermeabilität könnte demnach zur geringen Empfindlichkeit von B. bronchiseptica gegenüber β-Laktamen beitragen. Die Resistenzgene, die in porcinen B. bronchiseptica-Isolaten identifiziert wurden, unterschieden sich deutlich von denen anderer Erreger respiratorischer Erkrankungen, wie P. multocida. Ein Großteil der Gene war auf mobilen genetischen Elementen lokalisiert. Klasse 1 Integrons, die häufig in Enterobacteriaceae aber nicht in Pasteurellaeae vorkommen, wurden nachgewiesen. Plasmid-lokalisierte Gene konnten in E. coli übertragen werden und vermittelten die erwarteten Resistenzeigenschaften auch in diesen Bakterien, was auf einen Austausch von Resistenzgenen zwischen Enterobacteriaceae und B. bronchiseptica hindeutet.