Experimentelle Infektion von TNF[alpha]-transgenen Mäusen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit

Es war Ziel dieser Arbeit, den Einfluss des proinflammatorischen Zytokines Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) auf die Klinik, Entzündungsreaktion und Virusausbreitung nach experimenteller Infektion von Mäusen mit dem neurotropen Virus der Bornaschen Krankheit (BDV) zu untersuchen. Dazu wurden TNF-transgene Mäuse mit einer moderaten neuronalen TNF-Überexpression und nicht-transgene Tiere gleichen genetischen Hintergrunds neonatal mit einer mausadaptierten BDV-Präparation intrazerebral infiziert. Durch den Einsatz homo- und heterozygot transgener Tiere konnten unterschiedlich hohe TNF-Level im Gehirn erzeugt und verglichen werden. Zur Durchführung dieser Studie wurde zunächst die Comparative Quantitation real time-Polymerase Kettenreaktion etabliert, um die Nachzucht der Mauspopulation in drei Mausgruppen, nicht-transgen, hetero- und homozygot transgen, einordnen zu können. Die Tiere wurden wöchentlich klinisch-neurologisch untersucht. Nach der Sektion wurden die pathohistologischen Veränderungen der Mäuse­gehirne ausgewertet und immunhistologisch das virale Nukleoprotein (BDV-N) und Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)-reaktive Astrozyten dargestellt. An ausgewählten Zeitpunkten wurde die Expression des viralen Matrix- (BDV-M) und Glykoprotein (BDV-GP) ebenfalls mit Hilfe von Immunhistologie untersucht. Mittels in situ Hybridisierung und quantitativer Reverser Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) wurde die Verteilung und Anzahl verschiedener virale RNAs (ssBDV-N, ssBDV-Intron I, ssBDV-GP) analysiert. Weiterhin wurden die Entzündungszellen in den Gehirnen der BDV-infizierten Mäuse immunhistologisch näher charakterisiert. Aus nativem Gehirnmaterial wurde infektiöses Virus isoliert und der Nachweis von virusspezifischen Antikörpern erfolgte serologisch. Abschließend wurde das Vorhandensein entzündlicher Läsionen und die zentrifugale Ausbreitung des Virus in die Augen histologisch, immun­histologisch und mittels in situ Hybridisierung untersucht. Zwischen den drei BDV-infizierten Mausgruppen ergaben sich bei den klinisch-neurologischen Tests lediglich dezente Unterschiede. Auffällig waren die deutlichen, teils signifikant geringeren Gewichts­zunahmen der BDV-infizierten Tiere im Vergleich zu den mock-infizierten Mäusen und die geringere Zunahme der transgenen Tiere im Vergleich zu den nicht-transgenen Tieren. In den Gruppen der transgenen BDV-infizierten Tiere traten spontane, epileptiforme Krämpfe auf, die bei ntg Mäusen nicht beobachtet wurden. Die homozygoten transgenen Tiere zeigten diese häufiger und schon ab 21 Tagen post infectionem (p.i.), während bei den heterozygoten transgenen Mäusen die Krämpfe erst ab 42 Tagen p.i. beobachtet wurden. In allen drei BDV-infizierten Mausgruppen konnte eine disseminierte Ausbreitung der viralen Proteine BDV-N und BDV-M im Gehirn fest­gestellt werden, eine BDV-GP Expression dagegen war nur in einzelnen Neuronen in einigen Gehirngebieten nachweisbar. Auf Proteinebene konnte hinsichtlich der Ausbreitung, Zelltropismus und intrazellulärer Lokalisation der Virusantigene zwischen den drei Mausgruppen kein Unterschied festgestellt werden. Die in situ Hybridisierung (ISH) und qRT-PCR ergaben hingegen Hinweise auf eine unterschiedliche Regulierung der Replikation und Ausbreitung des BDV bei nicht-transgenen und transgenen Mäusen. Die genomische RNA war bei nicht-transgenen Tieren in einer signifikant ansteigenden Anzahl von Zellen über den Unter­suchungs­zeitraum nachweisbar, wogegen in beiden transgenen Mausgruppen die Anzahl RNA-haltiger Zellen in diesem Zeitraum nahezu konstant blieb. Die positiv orientierten RNAs, im wesentlichen die jeweilige virale mRNA, zeigten bei nicht-transgenen Tieren ebenfalls eine stete Zunahme RNA-haltiger Neurone in der ISH, während mittels qRT-PCR relativ konstante Kopienzahlen am 21. und 42. Tag p.i. quantifiziert wurden. Bei beiden transgenen Mausgruppen war hingegen eine nahezu konstante Anzahl BDV-RNA positiver Zellen zu beobachten, jedoch waren quantitativ differierende Werte zwischen 21 und 42 Tagen p.i. messbar. Die intrazelluläre Verteilung der mRNAs gab Aufschluss über potentielle Regulationsmechanismen der Transkription und zeigte, dass bei Mäusen sowohl ungespleißte als auch gespleißte Virus-RNA aus dem Zellkern exportiert werden kann. Die Diskrepanz zwischen hoher Trankriptexpression und restriktiver Expression des Proteins BDV-GP, weißt auf eine Restriktion der Translation und möglicherweise anteilige Retention der ungespleißten RNA im Zellkern hin. Die geringen Mengen von Antigenom in allen drei Mausgruppen weisen ebenfalls auf eine strikte regulierte Virus­replikation hin, was möglicherweise eine der Strategien darstellt über die das BDV eine persistierende Infektion des ZNS etablieren kann. Infektiöses Virus konnte jedoch aus Gehirnen aller drei Mausgruppen 28 und 49 Tage p.i. isoliert werden. In Bezug auf die Entzündungsreaktion konnte eine deutliche Korrelation mit dem transgenen Status der Tiere festgestellt werden. Die nicht-transgenen Tiere zeigten eine geringgradige Entzündungszellinfiltration ohne Progression im Verlauf der Studie, dagegen war in beiden transgenen Mausgruppen ein signifikanter Anstieg der Meningoenzephalitis mit Läsionen vorwiegend in den TNF-exprimierenden Arealen und korrespondierender Astrogliose und Mikroglia­aktivierung festzustellen. Auffällig waren im Ammonshorn trotz hoher Transgen-Expression meistens nur dezente Entzündungszellinfiltrate. Interessanterweise war auch bei den nicht-transgenen BDV-infizierten Tieren trotz geringer Entzündungszellinfiltration eine deutliche Astrogliose zu beobachten. Die TNF-Über­expression zeigte zwar einen Einfluss auf die Ausprägung der Entzündung, nicht aber auf die qualitative Beteiligung der einzelnen Immunzellpopulationen. Unter den eingewanderten, perivaskulären Entzündungs­zellen waren in allen drei Mausgruppen vor allem T-Zellen und Makrophagen sowie B-Zellen zu finden. Die Klassifizierung der T-Zellen ergab eine 5- bis 7,5-fache Dominanz der CD4+ gegenüber den CD8+ T-Zellen, unabhängig vom transgenen Status der Tiere. Parenchymal waren vor allem bei den transgenen Mausgruppen insbesondere einzelne CD3+ und CD4+ T-Zellen zu finden. Bei Untersuchung des Auges konnte in allen drei Mausgruppen eine anterograde Ausbreitung des BDV über den N. opticus in die Retina festgestellt werden, entzündliche oder degenerative Veränderungen fehlten. Die vorliegende Studie weist daraufhin, dass eine TNF-Überexpression bei BDV-infizierten Mäusen epileptiforme Krämpfe induziert. Diese stehen vermutlich mit der signifikant stärkeren Entzündungsreaktion und korrespondierender Mikrogliaaktivierung im Zusammen­hang. Die TNF-Überexpression hatte jedoch keinen Einfluss auf die qualitative Zusammen­setzung der Entzündungszellinfiltrate. In diesem Mausmodell ergaben sich Hinweise auf regulierte virale Strategien zur Ausbreitung, Replikation und Persistenz, die in vergleichbarer Weise bei transgenen und nicht-transgenen Tiere zu beobachten waren, sich jedoch anhand der generell geringen Anzahl RNA-haltiger Zellen bei transgenen Tieren unterschieden.