Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Transkription, Replikation und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit im Gehirn von experimentell infizierten Lewis Ratten mittels real-time RT-PCR

Porombka, Doris

It was the aim of the study to analyze systematically the transcription and replication efficiency of the Borna disease virus (BDV) in defined brain regions and cell types in experimentally infected Lewis rats. The object was to examine, whether a regulated expression of glycoprotein (BDV-GP)-encoding RNA in defined brain areas could be responsible for a local restricted expression of the BDV-GP in the course of the disease. Therefore, Lewis rats were infected intracerebrally with a rat-adapted BDV-preparation and brains were collected at 14, 24, 42 and 90 days post infection (p.i.). This allowed to study viral transcription and replication efficiency in the acute and chronic phase of the disease. Brain areas with notable (hippocampus) and with no detectable BDV-GP expression (caudoputamen) were isolated using laser microbeam microdissection. Furthermore, neurons of the CA3 region and hippocampal astrocytes were also harvested using laser microdissection and pressure catapulting. Samples deriving from total brain sections were included in this study as reference for the amount of viral transcription and replication. Transcripts specific for the nucleoprotein (BDV-N) and BDV-GP (BDV-GP-N and BDV-GP-C) were precisely quantified using real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR). Since the glycoprotein expression is tightly regulated by alternative splicing of intron I, values of BDV-Intron I- specific RNA were quantified as well. Furthermore, the amounts of full length antigenomic RNA (BDV-AG) were quantified to investigate the replication efficiency in both brain regions over time. For each viral RNA investigated, reverse transcription was carried out using the specific antisense primer, in order to amplify exclusively positive orientated RNA. The distribution and subcellular localization of BDV-Intron I +ssRNA and the corresponding genomic RNA were analyzed by in situ-hybridisation (ISH). The real-time RT-PCR-assay used in this study was successfully established and described for the first time for BDV-infected material of experimentally infected Lewis rats. All transcripts isolated from brain sections increased significantly between 14 and 24 days p.i. Afterwards, BDV-GP-, BDV-Intron I- and BDV-AG-specific +ssRNAs were expressed comparably high as at day 24 p.i., while BDV-N-transcripts dropped significantly to day 90 p.i. A regional influence on transcript values was found in the hippocampus. In general, BDV-N, BDV-GP and BDV-AG +ssRNAs were significantly higher expressed in the hippocampus compared to the caudoputamen. Interestingly, no regional differences were found for BDV-Intron I-specific transcripts.  However, the viral RNA expression was differently regulated in the acute and chronic phase of the disease in both brain regions. No influence of time p.i. on the amounts of BDV-N-, BDV-GP- and BDV-Intron I-specific copy numbers was seen in the hippocampus. A steady expression level of these transcripts was found during the whole investigation period, but the transcripts increased most abundantly in the acute phase of the disease between 14 and 24 days p.i. In contrast, increasing amounts of BDV-N, BDV-GP and BDV-Intron I +ssRNAs were detected in the caudoputamen. In the chronic phase at 90 days p.i., +ssRNA values in the caudoputamen were comparable to values measured in the hippocampus. BDV-AG +ssRNA displayed a different expression pattern. A steady rise of copy numbers was noted in the hippocampus with an expression maximum at 90 days p.i. In the caudoputamen, BDV-AG +ssRNA was first detectable at 24 days p.i. and increased only until 42 days p.i. Only BDV-N-specific transcripts displayed a different transcription efficiency on a cellular level. In more detail, a general higher expression of BDV-N-specific transcripts was seen in neurons. For BDV-GP- and BDV-Intron I-specific +ssRNA, no general differences on cellular transcript amounts were observed. However, using pairwise comparison, significantly higher levels of BDV-N +ssRNA were found at 24 days p.i. and at 42 days p.i. for BDV-GP-N and BDV-Intron I +ssRNA. The single cell analyses revealed a predominantly temporal regulation of BDV-specific transcripts in neurons. Here, the expression maximum of BDV-N and BDV-Intron I +ssRNA was detected at 24 days p.i., while highest levels of BDV-GP +ssRNA were found at 42 days p.i. In astrocytes, BDV-N- and BDV-GP-specific transcripts varied not significantly between all time points investigated. Only BDV-Intron I +ssRNA increased significantly from 14 to 24 days p.i. in astrocytes. Comparing the expression levels in general, BDV-N +ssRNA was most abundantly expressed, which is consistent with the 3’-5’ transcription gradient seen in Mononegavirales. In contrast, antigenomic RNAs were found in lowest amounts. Remarkably, almost comparable copy number levels were detected for the BDV-GP and BDV-Intron I +ssRNA. This indicates a low splicing efficiency of the viral intron I. As an exception, at day 24 p.i. significantly higher amounts of BDV-Intron I +ssRNA compared to BDV-GP-C +ssRNA were detected in neurons. Also a statistically relevant higher expression compared to BDV-GP-N +ssRNA was measured. The restrictive expression of BDV-AG +ssRNA and the low splicing efficiency of BDV-Intron I might represent different strategies for BDV to control the BDV-GP expression and to establish the viral persistence. By ISH, BDV-Intron I +ssRNA and genomic RNA did not reveal a significant increase of BDV-RNA containing cells over time. In accordance with existing quantitative data, a disseminated occurrence of BDV-Intron I +ssRNA was observed in the hippocampus already at day 14 p.i. However, a different subcellular localisation of BDV-Intron I +ssRNA was detectable during the investigation period. Until day 24 p.i., BDV-Intron I +ssRNA was found mainly within the cytoplasm and/ or nucleus. From day 42 p.i. on, BDV-Intron I +ssRNA was shown to be predominantly found in the nucleus. Interestingly, a diffuse cytoplasmatic reaction was observed in the hippocampus over the entire investigation period. Genomic RNA was mainly located within the nucleus. From day 24 p.i. on, genomic RNA was also detectable in the hippocampal mossy fibres. BDV-N, BDV-GP-C and BDV-Intron I +ssRNA and genomic RNA was detected mainly in the nucleus of astrocytes and oligodendrocytes via double-labelling. Comparing the general expression levels of BDV-N-, BDV-GP-, BDV-Intron I- and BDV-AG-specific +ssRNA in total brain section, defined brain regions and single cell types in the course of the disease, various regulatory mechanisms are operative at different molecular levels during the experimental infection of adult Lewis rats. In more detail, a local restricted transcription and replication efficiency and a low splicing efficiency seem to be necessary to allow a limited BDV-GP expression and virus persistence. Moreover, the viral transcript expression is differently regulated in neurons and astrocytes in the acute and the chronic phase of the disease. In conclusion, this study served to shed some light on the viral replication and transcription efficiency in the course of BDV-infection. This contributes to the understanding of various strategies that determine viral tropism, virus spread and persistence in the CNS of BDV-infected animals.

Ziel dieser Arbeit war die systematische Untersuchung der Transkription und Replikation des Virus der Bornaschen Krankheit (Borna disease virus, BDV) in definierten Gehirnarealen und Zellpopulationen in experimentell infizierten Lewis Ratten. Insbesondere sollte dabei analysiert werden, ob die lokal limitierte und temporär differierende Glykoprotein (BDV-GP)-Expression ursächlich mit einer regulierten Transkription der BDV-GP-kodierenden +ssRNA in den entsprechenden Gehirnarealen und Zelltypen zusammenhängen könnte. Dazu wurden Lewis Ratten intrazerebral mit einer rattenadaptierten BDV-Präparation infiziert und die Gehirne am 14., 24., 42. und 90. Tag post infectionem (p.i.) entnommen. Die Wahl dieser Zeitpunkte erlaubte die Untersuchung der viralen Transkriptions- und Replikationseffizienz im akuten wie im chronischen Stadium der Infektion. Gehirnregionen mit nachweisbarer (Ammonshorn) und Gehirnregionen mit nicht nachweisbarer BDV-GP-Expression (Nucleus caudatus/ Putamen [CPu]) wurden mittels Laser Microbeam Microdissection selektiv gewonnen. Zusätzlich erfolgte eine Isolation einzelner Neuronen der CA3-Region und Astrozyten des Ammonshorns mittels Laser Microbeam and Pressure Catapulting. Als Referenzwerte für die virale Transkription und Replikation wurden Proben aus einem gesamten Gehirnschnitt in die Untersuchung miteinbezogen. Die in den Proben enthaltenen Nukleoprotein (BDV-N)- und BDV-GP (BDV-GP-N und BDV-GP-C)-spezifischen Transkripte wurden mit Hilfe der real-time reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion (real-time RT-PCR) präzise quantifiziert. Da alternatives Spleißen des viralen Intron I essentiell für die effektive Translation des BDV-GP ist, wurde der Anteil BDV-Intron I-enthaltender +ssRNAs ebenfalls bestimmt. Die Quantifizierung des viralen Antigenoms (BDV-AG) diente der Analyse der viralen Replikationseffizienz in den untersuchten Gehirnregionen zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion. Durch die Verwendung des spezifischen antisense-Primer für die reverse Transkription wurde eine strangspezifische Amplifikation ausschließlich positiv orientierter RNA gewährleistet. Die morphologisch-topographische Untersuchung der BDV-Intron I +ssRNA mittels in situ-Hybridisierung (ISH) und der korrespondierenden genomischen RNA erfolgte zur Analyse der Anzahl positiver Zellen und der subzelluläre Verteilung dieser BDV-RNA im zeitlichen Verlauf. In der vorliegenden Studie wurde das real-time RT-PCR-Assay zum Nachweis der BDV-GP-, BDV-Intron I und BDV-AG-spezifischen +ssRNAs in BDV-infizierten Rattengehirnen erstmals erfolgreich etabliert und beschrieben. In den Proben aus dem gesamten Gehirnschnitt war eine signifikante Zunahme aller viralen Transkriptmengen vom 14. zum 24. Tag p.i. festzustellen. Während BDV-GP-, BDV-Intron I- und BDV-AG-spezifische +ssRNA danach auf annähernd gleichem Niveau exprimiert wurden, nahmen BDV-N-spezifische Transkripte zum 90. Tag p.i. signifikant ab. Bei der Analyse der Transkriptmengen in den unterschiedlichen Gehirnarealen wurde ein regionaler Einfluss des Ammonshorn auf die +ssRNA-Menge bestätigt. Die Quantifizierung der BDV-N-, BDV-GP- und BDV-AG-spezifischen +ssRNA ergab eine generell signifikant höhere +ssRNA-Menge im Ammonshorn als im CPu. Lediglich für BDV-Intron I-spezifische Transkripte konnten keine regional unterschiedlichen Mengen detektiert werden. Die virale +ssRNA-Expression war im akuten und chronischen Stadium der Infektion in beiden Gehirnarealen unterschiedlich reguliert. Eine signifikante Zu- oder Abnahme der BDV-N-, BDV-GP- und BDV-Intron I-spezifischen Transkripte im Verlauf der Untersuchung war im Ammonshorn nicht zu erkennen. Diese Transkripte lagen hier relativ stabil über den gesamten Untersuchungszeitraum exprimiert vor, die offensichtlichste Zunahme erfolgte jedoch vom 14. zum 24. Tag p.i. Im Gegensatz dazu nahmen die nachweisbaren Mengen der BDV-N-, BDV-GP und BDV-Intron I-spezifischen viralen +ssRNAs im CPu kontinuierlich zu und erreichten am 90. Tag p.i. vergleichbare Werte wie im Ammonshorn. Ein abweichendes Expressionsmuster lag für BDV-AG +ssRNA vor. Die nachweisbaren Mengen dieser +ssRNA stiegen im Ammonshorn signifikant bis zum 90. Tag p.i. an. Im CPu war BDV-AG +ssRNA erstmals am 24. Tag p.i. nachweisbar und die +ssRNA nahm nur bis zum 42. Tag p.i. zu. Ein Effekt des Zelltyps auf die Transkriptionsleistung konnte lediglich für BDV-N +ssRNA festgestellt werden. In Neuronen war eine generell höhere Expression von BDV-N-spezifischen Transkripten im Vergleich zu Astrozyten feststellbar. Für BDV-GP und BDV-Intron I +ssRNA wurden keine generellen, zellspezifischen Mengenunterschiede ermittelt. Jedoch konnte mittels paarweisem Vergleich am 24. Tag p.i. signifikant mehr BDV-N +ssRNA bzw. am 42. Tag p.i. signifikant mehr BDV-GP-N und BDV-Intron I +ssRNA in Neuronen nachgewiesen werden. Generell lag in Neuronen eine signifikante zeitliche Regulation von allen untersuchten BDV +ssRNAs vor. Eine maximale Expression in Neuronen war für BDV-N- und BDV-Intron I-spezifische +ssRNA am 24. Tag p.i. nachweisbar, während die größten Mengen BDV-GP-spezifischer Transkripte am 42. Tag p.i. detektiert wurden. In Astrozyten waren die BDV-N- und BDV-GP-spezifischen Transkripte konstant über den gesamten Untersuchungszeitraum und auf annähernd gleichem Niveau nachweisbar. Lediglich für BDV-Intron I +ssRNA konnte eine signifikante Zunahme am 24. Tag p.i. in Astrozyten beobachtet werden. In Relation zu allen weiteren Transkripten war BDV-N-spezifische +ssRNA im Gehirnschnitt, den Gehirnarealen und in den Einzelzellen zu allen Zeitpunkten p.i. in den größten Mengen nachweisbar, was dem 3’-5’-Transkriptionsgradienten der Mononegavirales entspricht. BDV-AG +ssRNA war dagegen immer am geringsten exprimiert. Bemerkenswerterweise wurden in allen Proben fast immer vergleichbare Werte für BDV-GP- und BDV-Intron I-spezifische Transkripte gefunden, die auf eine geringe Spleißeffizienz des BDV-Intron I hinweisen. Eine Ausnahme stellte der 24. Tag p.i. dar, an dem in Neuronen eine signifikant höhere Menge BDV-Intron I +ssRNA im Vergleich zu BDV-GP-C +ssRNA gemessen wurde bzw. eine statistisch auffällig höhere Expression gegenüber BDV-GP-N +ssRNA feststellbar war. Eine restriktive Expression der BDV-AG +ssRNA und eine geringe Spleißeffizienz von BDV-Intron I könnten verschiedene Strategien darstellen, über die das BDV seine Replikation und BDV-GP-Expression kontrolliert und die zur Etablierung der viralen Persistenz beitragen. Die ISH zum Nachweis von BDV-Intron I +ssRNA und der genomischen RNA ergab keine signifikante Zunahme von BDV-RNA-enthaltenden Zellen im Untersuchungszeitraum, jedoch war eine augenscheinliche Zunahme vom 14. auf den 24. Tag p.i. feststellbar. In Übereinstimmung mit den quantitativen Daten war im Ammonshorn bereits ab dem 14. Tag p.i. ein disseminiertes Vorkommen von BDV-Intron I +ssRNA zu beobachten. Im zeitlichen Verlauf war eine unterschiedliche subzelluläre Lokalisation der BDV-Intron I +ssRNA zu erkennen. Bis zum 24. Tag p.i. war die BDV-Intron I +ssRNA v.a. im Zytoplasma und/ oder Zellkern lokalisiert. Ab dem 42. Tag p.i. war eine vorwiegende Beschränkung der BDV-Intron I +ssRNA auf den Zellkern nachweisbar. Unbetroffen davon wurde im Ammonshorn weiterhin eine diffuse zytoplasmatische Reaktion beobachtet. Die genomische RNA trat vor allem im Zellkern auf. Ab dem 24. Tag p.i. war die genomische RNA in den Moosfasern des Ammonshorns nachweisbar. Mittels Doppelmarkierung wurden BDV-N, BDV-GP-C und BDV-Intron I +ssRNA und die genomische RNA in Astrozyten und Oligodendrozyten nachgewiesen. Durch den gezielten Vergleich der Expression der BDV-N-, BDV-GP-, BDV-Intron I- und BDV-AG-spezifischen +ssRNAs im gesamten Gehirnschnitt, in definierten Gehirnarealen und in einzelnen Zellpopulationen im Verlauf der Infektion konnte gezeigt werden, dass regulative Mechanismen auf verschiedenen molekularen Ebenen, wie eine regional determinierte Transkriptions- und Replikationeffizienz und eine geringe Spleißeffizienz zusammenwirken, um eine limitierte BDV-GP-Expression und die virale Persistenz zu ermöglichen. Die virale Transkriptexpression wurde dabei im zeitlichen Verlauf in Neuronen und Astrozyten unterschiedlich reguliert. In der vorliegenden Studie konnten wichtige Aussagen zur Replikations- und Transkriptionsleistung des BDV in der akuten wie in der chronischen Phase der Infektion gesammelt werden, die zum Verständnis des Virustropismus, der Virusausbreitung und Persistenz des BDV im ZNS von infizierten Tieren beitragen können.

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Porombka, Doris: Untersuchungen zur Transkription, Replikation und Persistenz des Virus der Bornaschen Krankheit im Gehirn von experimentell infizierten Lewis Ratten mittels real-time RT-PCR. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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