Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Expression von Strukturproteinen des Virus der Bornaschen Krankheit an intrazerebral infizierten Lewis-Ratten

Werner-Keišs, Nicole

1. In the introduction, an overview of the current knowledge on natural and experimental Borna Disease Virus (BDV) infections is given, followed by a characterization of the BDV and its proteins. The immunopathogenesis of Borna Disease (BD) and its interactions with the host are discussed. Additionally, the structure and functions of subtilisin-like proprotein-convertases (SPC) are briefly described. 2. Adult Lewis rats were inoculated intracerebrally with a rat-adapted BDV-preparation 5/25/92 and clinical signs were observed within an investigation period of 90 days p.i. Brain tissue was investigated histologically for the presence of inflammatory and degenerative changes. Various BDV-specific antigens were detected immunohistologically by using a monoclonal antibody directed against BDV-N and polyclonal, monospecific antibodies against BDV-GP and BDV-M. Their spatio-temporal distribution in the rat brain was semiquantitatively analysed. The proprotein convertases SPC4 and SPC6 were detected by polyclonal antibodies. In situ hybridisation for the detection of different viral RNAs was performed using DIG-labelled RNA probes specific for BDV-N RNAs (genomic RNA, mRNA) and RNAs specific for the two subunits of BDV-GP, the C-terminal and N-terminal part. In addition to the semiquantitative evaluation, hippocampal cells positive for BDV-N and –GP and the corresponding RNAs were counted and statistically analysed. Infectious virus was determined in brain tissue by titration in cell cultures applying indirect immunofluorescence test (IIFT). 3. The infected Lewis rats displayed the typical biphasic course of the disease with the first phase starting at day 14 p. i. and the second phase beyond day 31 p.i. Onset of clinical signs corresponded to the detection of inflammatory lesions in the infected rat brains. 4. All BDV-infected animals developed a non-purulent meningoencephalitis. At day 7 p.i., small mononuclear infiltrates were detected in the leptomeninx. Mononuclear perivascular infiltrates were present firstly at day 14 p.i. and were most prominent between day 31 and 42 p.i., accompanied by severe parenchymal mononuclear infiltrates. In later stages of the disease (day 50 p.i.), inflammatory infiltrates decreased and a mild to moderate hydrocephalus developed. Inflammatory infiltrates were mainly found in the cortex cerebri, the hippocampal formation, amygdala and thalamus. A reactive astrogliosis was observed starting approximately at day 24 p.i. 5. All three BDV-specific antigens were detected firstly at day 7 p.i. in the rat brain by immunohistochemistry. BDV-N was expressed in cytoplasm and nuclei of neurons, astrocytes, oligodendrocytes and ependymal cells as well as in neuronal processes and neuropil. At later time points p.i., BDV-M was detectable mainly in astrocytes and small neurons. In contrast to the disseminated occurrence of BDV-N and BDV-M throughout the entire brain, BDV-GP was expressed exclusively in the cytoplasm of single large neurons in the cerebral cortex, hippocampal formation, amygdala and thalamus. This might indicate a restricted BDV-GP expression. During the whole investigation period, expression of BDV-GP was significantly lower than the expression of BDV-N (p < 0,0001). The peak of BDV-GP detection occurred between day 18 and 24 p.i. which was earlier than maxima of BDV-N and BDV-M expression (starting at day 31 p.i. each). At later time points p.i., demonstration of BDV-GP and BDV-M decreased, while BDV-N remained expressed at maximum levels until the end of the investigation. 6. The investigated proprotein-convertases SPC4 and SPC6 were detected in BDV-infected as well as "Mock" - infected animals by immunohistochemistry at all time points investigated. The SPC expression did not correlate with BDV-infection and there was no difference between BDV- and "Mock"-infected brains. SPC4 was detected throughout the entire rat brain and was expressed in all cell compartments of neurons and glial cells. In contrast, SPC6A was found almost exclusively in the white matter, neuronal processes and neuropil of the corpus callosum, striatum/N. caudatus, thalamus, amygdala and mesencephalon. 7. All BDV-specific RNAs were detected firstly at day 7 p.i. by ISH. All RNAs were found throughout the entire rat brain, but expression of BDV-GP RNAs occurred in fewer cells in comparison to BDV-N RNAs and was predominantly present in the cortex cerebri, amygdale, hippocampal formation and thalamus. In contrast to the expression pattern of BDV-N mRNA, which was found mainly in neuronal processes and cytoplasm, but also in nuclei of neurons and ependymal cells, BDV-GP mRNA expression was restricted to the nuclei of cells. This points out a restriction of nuclear export of BDV-GP mRNA. In comparison with BDV-GP-N mRNA, the expression of BDV-GP was significantly lower (p = 0.0005), what is indicative of a restricted BDV-GP translation. In general, genomic RNA occurred only in nuclei of cells, but occassionally fibres could display a positive signal as well. The maximum of expression of BDV-N and BDV-GP RNAs extended from day 24 to 60 p.i. At the end of the investigation period, a slight decrease was noted. In total, significantly more cells were positive for BDV-N mRNA than for BDV-GP-N mRNA (p = 0,0007). 8. Infectious virus was isolated from BDV-infected brain tissue at day 50 and 75 p.i. with a titer of 2x107 ID50/ml. This titer is an evidence for virus replication during the infection. 9. The present study describes the spatio-temporal expression of BDV-N, BDV-M and BDV-GP as well as the RNAs of BDV-N and BDV-M during experimental BDV infection. The results of this in vivo study show, that different regulating and controlling mechanisms are operative for each viral mRNA and the corresponding proteins during experimental BDV infection of adult Lewis rats. In particular strategies as regional and cellular tropism of viral protein expression, regulation of transcription of the subgenomic RNAs and restriction of viral GP-translation seem to be involved. These in vivo mechanisms are most likely essential for an efficient and successful viral dissemination and persistence in the CNS of infected hosts.

In der Literaturübersicht wird der aktuelle Stand der Forschung über natürliche und experimentelle Infektionen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit (Borna Disease Virus, BDV) beschrieben. Das BDV und seine Proteine werden charakterisiert, es wird auf die Immunpathogenese und die Wechselwirkungen mit dem Wirtsorganismus eingegangen. Außerdem wird ein kurzer Einblick in die Struktur und die Funktionen der "subtilisin-like" Pro-Protein-Konvertasen gegeben. Adulte Lewis-Ratten wurden intrazerebral mit der Ratten-adaptierten BDV-Präparation 5/25/92 infiziert und die klinische Symptomatik über einen Zeitraum von bis zu 90 Tagen p.i. beobachtet. Die Gehirne wurden zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. histologisch auf das Vorhandensein entzündlicher und degenerativer Veränderungen untersucht. Verschiedene BDV-spezifische Antigene wurden immunhistologisch mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen das BDV-N und polyklonaler, monospezifischer Antikörper gegen BDV-GP und BDV-M nachgewiesen und ihre spatio-temporale Verteilung und Ausbreitung im Gehirn semiquantitativ analysiert. Die Pro-Protein-Konvertasen SPC4- und SPC6A wurden mittels polyklonaler Antikörper immunhistologisch detektiert. Zum Nachweis verschiedener viraler RNAs wurde eine in situ-Hybridisierung (ISH) mit DIG-markierten RNA-Sonden spezifisch für BDV-N RNAs (genomische RNA, mRNA) sowie für je zwei Untereinheiten der BDV-GP RNAs (kodierend für C-terminalen und N-terminalen Anteil des BDV-GP) durchgeführt. Zusätzlich wurden die für BDV-N und BDV–GP und deren korrespondierende RNAs positiven Zellen im Ammonshorn bestimmt und die Ergebnisse statistisch ausgewertet. Infektiöses Virus im Gehirn wurde durch Titration in Zellkulturen mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenztests (IIFT) nachgewiesen. Die BDV-infizierten Ratten zeigten klinisch den typischen biphasischen Verlauf der BD, wobei die erste Phase etwa am Tag 14 p.i. und die zweite ca. ab Tag 31 p.i. einsetzte. Der Beginn der klinischen Symptomatik war gleichzeitig mit dem Auftreten erster perivaskulärer Infiltrate im ZNS zu beobachten. Alle BDV-infizierten Tiere entwickelten eine nichteitrige Meningoenzephalitis. Histologisch konnten um Tag 7 p.i. erste mononukleäre Infiltrate in der Leptomeninx festgestellt werden. Die ersten perivaskulären Infiltrate traten an Tag 14 p.i. auf und waren am prominentesten zwischen Tag 31 und 42 p.i., begleitet von hochgradigen mononukleären parenchymalen Infiltraten. Ab Tag 50 p.i. wurden die entzündlichen Infiltrate weniger und es entwickelte sich zumeist ein Hydrocephalus internus. Entzündliche Infiltrate wurden vorwiegend in Cortex cerebri, Hippocampus, Amygdala und Thalamus beobachtet. Eine reaktive Astrogliose entwickelte sich ab Tag 24 p.i. 5. Immunhistologisch wurden die drei untersuchten BDV-spezifischen Antigene am Tag 7 p. i. erstmals im Gehirn nachgewiesen. BDV-N war im Zytoplasma und in Kernen von Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen, in neuronalen Fortsätzen und im Neuropil detektierbar. BDV-M konnte insbesondere zu späteren Zeitpunkten verstärkt in Astrozyten und kleinen Neuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz zum disseminierten Auftreten von BDV-N und BDV-M im gesamten Gehirn war BDV-GP nur im Zytoplasma einzelner großer Neurone im Cortex cerebri, Hippocampus, Amygdala und Thalamus detektierbar. Dies weist auf eine restriktive BDV-GP Expression hin. Im gesamten Untersuchungszeitraum war die Expression von BDV-GP signifikant niedriger als die Expression von BDV-N (p < 0.0001). Das Maximum des BDV-GP-Nachweises trat bereits zwischen Tag 18 und 24 p.i. auf und lag somit früher als die Maxima von BDV-N und BDV-M (beide ab Tag 31 p.i.). Zu späteren Zeitpunkten nahm das Vorkommen von BDV-GP und BDV-M ab, während BDV-N bis zum Ende des Untersuchungszeitraums maximal exprimiert blieb. 6. Die untersuchten Pro-Protein-Konvertasen SPC4 und SPC6A waren immunhistologisch sowohl in den BDV-infizierten Tieren als auch in den "Mock"-infizierten Tieren zu allen untersuchten Zeitpunkten p.i. nachweisbar. Eine Korrelation der SPC-Expression mit der BDV-Infektion war nicht zu erkennen, und es bestand kein Unteschied zwischen BDV-infizierten und "Mock"-infizierten Gehirnen. SPC4 fand sich weit verbreitet im gesamten Gehirn und war in allen Zellkompartimenten von Neuronen und Gliazellen nachweisbar. SPC6A war hingegen fast ausschließlich in der weißen Substanz sowie in Fortsätzen und Neuropil in Corpus callosum, Striatum, Thalamus, Amygdala und Mesencephalon zu finden. In der in situ-Hybridisierung waren alle untersuchten BDV-spezifischen RNA ab Tag 7 p.i. in Gehirnen infizierter Tiere nachweisbar. Alle RNAs waren im gesamten Gehirn detektierbar, wobei BDV-GP-RNAs in weniger Zellen auftraten als BDV-N RNAs und nur in Cortex cerebri, Amygdala, Ammonshorn und Thalamus verstärkt nachweisbar waren. Im Gegensatz zur BDV-N mRNA, die vorrangig in Zytoplasma und Fortsätzen, aber zum Teil auch in Kernen von Neuronen und Ependymzellen nachweisbar war, konnte BDV-GP mRNA fast ausschließlich in Zellkernen detektiert werden, was auf eine Restriktion des nukleären Exports hinweist. Im Vergleich war, bezogen auf das Ammonshorn, die BDV-GP-Expression gegenüber der BDV-GP-N mRNA signifikant niedriger (p = 0,0005). Dies deutet auf eine regulierte Translation des BDV-GP hin. Genomische RNA trat generell vorwiegend in Zellkernen auf, wobei einige wenige zytoplasmatische Reaktionen zu beobachten waren. Teilweise war genomische BDV-GP RNA auch in Fasern nachweisbar. Das Maximum der Ausbreitung der BDV-N und BDV-GP RNAs erstreckte sich vom Tag 24 bis Tag 60 p.i. Gegen Ende der Untersuchung war ein geringgradiger Rückgang zu beobachten. Insgesamt waren im Ammonshorn signifikant mehr Zellen positiv für BDV-N mRNA als für BDV-GP-N mRNA (p = 0,0007). 8. An den Tagen 50 und 75 p.i. wurde aus BDV-infiziertem Gehirnmaterial infektiöses Virus in einem Titer von 2x107 ID50/ml isoliert. Dies gibt einen Hinweis auf eine produktive BDV-Infektion. 9. Die vorliegenden Ergebnisse geben Aufschluss über die spatio-temporale Expression des viralen Strukturproteine BDV-N, BDV-M und BDV-GP und der korrespondierenden viralen RNAs im Gehirn im Verlauf einer experimentellen BDV-Infektion. Diese in vivo Studie zeigt, dass unterschiedliche regulierende und kontrollierende Mechanismen für die Expression der einzelnen viralen mRNAs und deren Proteine während der experimentellen BDV-Infektion adulter Lewis-Ratten vorliegen. Hierzu zählen insbesondere der regionale und zelluläre Tropismus viraler Proteinexpression, die Regulation der Transkription subgenomischer RNAs sowie die Restriktion der viralen Glykoproteintranslation. Diese Strategien stellen vermutlich wesentliche Faktoren zur effizienten Virusausbreitung und Persistenz im ZNS des infizierten Wirtes dar.

Zitieren

Zitierform:

Werner-Keišs, Nicole: Untersuchungen zur Expression von Strukturproteinen des Virus der Bornaschen Krankheit an intrazerebral infizierten Lewis-Ratten. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export