Untersuchungen zur Expression von Strukturproteinen des Virus der Bornaschen Krankheit an intrazerebral infizierten Lewis-Ratten

In der Literaturübersicht wird der aktuelle Stand der Forschung über natürliche und experimentelle Infektionen mit dem Virus der Bornaschen Krankheit (Borna Disease Virus, BDV) beschrieben. Das BDV und seine Proteine werden charakterisiert, es wird auf die Immunpathogenese und die Wechselwirkungen mit dem Wirtsorganismus eingegangen. Außerdem wird ein kurzer Einblick in die Struktur und die Funktionen der "subtilisin-like" Pro-Protein-Konvertasen gegeben. Adulte Lewis-Ratten wurden intrazerebral mit der Ratten-adaptierten BDV-Präparation 5/25/92 infiziert und die klinische Symptomatik über einen Zeitraum von bis zu 90 Tagen p.i. beobachtet. Die Gehirne wurden zu verschiedenen Zeitpunkten p.i. histologisch auf das Vorhandensein entzündlicher und degenerativer Veränderungen untersucht. Verschiedene BDV-spezifische Antigene wurden immunhistologisch mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen das BDV-N und polyklonaler, monospezifischer Antikörper gegen BDV-GP und BDV-M nachgewiesen und ihre spatio-temporale Verteilung und Ausbreitung im Gehirn semiquantitativ analysiert. Die Pro-Protein-Konvertasen SPC4- und SPC6A wurden mittels polyklonaler Antikörper immunhistologisch detektiert. Zum Nachweis verschiedener viraler RNAs wurde eine in situ-Hybridisierung (ISH) mit DIG-markierten RNA-Sonden spezifisch für BDV-N RNAs (genomische RNA, mRNA) sowie für je zwei Untereinheiten der BDV-GP RNAs (kodierend für C-terminalen und N-terminalen Anteil des BDV-GP) durchgeführt. Zusätzlich wurden die für BDV-N und BDV–GP und deren korrespondierende RNAs positiven Zellen im Ammonshorn bestimmt und die Ergebnisse statistisch ausgewertet. Infektiöses Virus im Gehirn wurde durch Titration in Zellkulturen mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenztests (IIFT) nachgewiesen. Die BDV-infizierten Ratten zeigten klinisch den typischen biphasischen Verlauf der BD, wobei die erste Phase etwa am Tag 14 p.i. und die zweite ca. ab Tag 31 p.i. einsetzte. Der Beginn der klinischen Symptomatik war gleichzeitig mit dem Auftreten erster perivaskulärer Infiltrate im ZNS zu beobachten. Alle BDV-infizierten Tiere entwickelten eine nichteitrige Meningoenzephalitis. Histologisch konnten um Tag 7 p.i. erste mononukleäre Infiltrate in der Leptomeninx festgestellt werden. Die ersten perivaskulären Infiltrate traten an Tag 14 p.i. auf und waren am prominentesten zwischen Tag 31 und 42 p.i., begleitet von hochgradigen mononukleären parenchymalen Infiltraten. Ab Tag 50 p.i. wurden die entzündlichen Infiltrate weniger und es entwickelte sich zumeist ein Hydrocephalus internus. Entzündliche Infiltrate wurden vorwiegend in Cortex cerebri, Hippocampus, Amygdala und Thalamus beobachtet. Eine reaktive Astrogliose entwickelte sich ab Tag 24 p.i. 5. Immunhistologisch wurden die drei untersuchten BDV-spezifischen Antigene am Tag 7 p. i. erstmals im Gehirn nachgewiesen. BDV-N war im Zytoplasma und in Kernen von Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Ependymzellen, in neuronalen Fortsätzen und im Neuropil detektierbar. BDV-M konnte insbesondere zu späteren Zeitpunkten verstärkt in Astrozyten und kleinen Neuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz zum disseminierten Auftreten von BDV-N und BDV-M im gesamten Gehirn war BDV-GP nur im Zytoplasma einzelner großer Neurone im Cortex cerebri, Hippocampus, Amygdala und Thalamus detektierbar. Dies weist auf eine restriktive BDV-GP Expression hin. Im gesamten Untersuchungszeitraum war die Expression von BDV-GP signifikant niedriger als die Expression von BDV-N (p < 0.0001). Das Maximum des BDV-GP-Nachweises trat bereits zwischen Tag 18 und 24 p.i. auf und lag somit früher als die Maxima von BDV-N und BDV-M (beide ab Tag 31 p.i.). Zu späteren Zeitpunkten nahm das Vorkommen von BDV-GP und BDV-M ab, während BDV-N bis zum Ende des Untersuchungszeitraums maximal exprimiert blieb. 6. Die untersuchten Pro-Protein-Konvertasen SPC4 und SPC6A waren immunhistologisch sowohl in den BDV-infizierten Tieren als auch in den "Mock"-infizierten Tieren zu allen untersuchten Zeitpunkten p.i. nachweisbar. Eine Korrelation der SPC-Expression mit der BDV-Infektion war nicht zu erkennen, und es bestand kein Unteschied zwischen BDV-infizierten und "Mock"-infizierten Gehirnen. SPC4 fand sich weit verbreitet im gesamten Gehirn und war in allen Zellkompartimenten von Neuronen und Gliazellen nachweisbar. SPC6A war hingegen fast ausschließlich in der weißen Substanz sowie in Fortsätzen und Neuropil in Corpus callosum, Striatum, Thalamus, Amygdala und Mesencephalon zu finden. In der in situ-Hybridisierung waren alle untersuchten BDV-spezifischen RNA ab Tag 7 p.i. in Gehirnen infizierter Tiere nachweisbar. Alle RNAs waren im gesamten Gehirn detektierbar, wobei BDV-GP-RNAs in weniger Zellen auftraten als BDV-N RNAs und nur in Cortex cerebri, Amygdala, Ammonshorn und Thalamus verstärkt nachweisbar waren. Im Gegensatz zur BDV-N mRNA, die vorrangig in Zytoplasma und Fortsätzen, aber zum Teil auch in Kernen von Neuronen und Ependymzellen nachweisbar war, konnte BDV-GP mRNA fast ausschließlich in Zellkernen detektiert werden, was auf eine Restriktion des nukleären Exports hinweist. Im Vergleich war, bezogen auf das Ammonshorn, die BDV-GP-Expression gegenüber der BDV-GP-N mRNA signifikant niedriger (p = 0,0005). Dies deutet auf eine regulierte Translation des BDV-GP hin. Genomische RNA trat generell vorwiegend in Zellkernen auf, wobei einige wenige zytoplasmatische Reaktionen zu beobachten waren. Teilweise war genomische BDV-GP RNA auch in Fasern nachweisbar. Das Maximum der Ausbreitung der BDV-N und BDV-GP RNAs erstreckte sich vom Tag 24 bis Tag 60 p.i. Gegen Ende der Untersuchung war ein geringgradiger Rückgang zu beobachten. Insgesamt waren im Ammonshorn signifikant mehr Zellen positiv für BDV-N mRNA als für BDV-GP-N mRNA (p = 0,0007). 8. An den Tagen 50 und 75 p.i. wurde aus BDV-infiziertem Gehirnmaterial infektiöses Virus in einem Titer von 2x107 ID50/ml isoliert. Dies gibt einen Hinweis auf eine produktive BDV-Infektion. 9. Die vorliegenden Ergebnisse geben Aufschluss über die spatio-temporale Expression des viralen Strukturproteine BDV-N, BDV-M und BDV-GP und der korrespondierenden viralen RNAs im Gehirn im Verlauf einer experimentellen BDV-Infektion. Diese in vivo Studie zeigt, dass unterschiedliche regulierende und kontrollierende Mechanismen für die Expression der einzelnen viralen mRNAs und deren Proteine während der experimentellen BDV-Infektion adulter Lewis-Ratten vorliegen. Hierzu zählen insbesondere der regionale und zelluläre Tropismus viraler Proteinexpression, die Regulation der Transkription subgenomischer RNAs sowie die Restriktion der viralen Glykoproteintranslation. Diese Strategien stellen vermutlich wesentliche Faktoren zur effizienten Virusausbreitung und Persistenz im ZNS des infizierten Wirtes dar.