Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell

Kleinschmidt, Kerstin

Glioblastoma multiforme (GBM) has an incidence of 4000-5000 cases every year. Despite the use of all known treatments, GBM still has a poor prognosis. Having contracted GBM, the medium term life expectancy is 12 to 15 months after diagnosis. A new treatment opportunity in the abatement against this rapidly growing tumour is based on antiangiogenic mechanisms. The aim, by suppressing the neovascularization and thus starving the GBM, is to achieve growth inhibition and necrotization of the tumour-tissue. Endostatin, an endogenous 22 kD protein, is an auspicious angiogenesis inhibitor. But due to its short half-time and the barrier function of the blood-brain-barrier problems arise with its administration. Thus, effective protein concentrations are not achievable with systematic application. The use of genetically engineered mesenchymal stem cells expressing endostatin (EMSCs) allows a constant protein production. By encapsulating these EMSCs with a nutrient and oxygen permeable alginate matrix the intracerebral implantation at the target site is possible. This alginate capsule insulates the EMSCs from the components of the recipient’s immune response. Alginate is an algine-acid polymer from marine brown-alga with a good biocompatibility. To generate the CellBeads® (CBs) used in this study, an alginate with high guluronic acid concentration (high G-alginate) linked with Barium ions was applied. The task of this dissertation was to standardise a GBM model and to examine the antiangiogenic and the tumour reducing effects of alginate-CBs containing EMSCs. In order to have a reproducible experimental GBM, BT4Ca-Glioma cells were injected into the right hemisphere of BDIX/Ztm-rats. The day after glioma inoculation CBs were stereotactically implanted near the GBM approaching the ventricle. A control group (BT4Ca only), a group with empty CBs (LCB), a group with stem cells without endostatin secretion (SCB) and a group with endostatin beads (ECB) were examined after 12 days. The implants could be histologically proven to be intact and no immunological reactions of the host animals were witnessed. The endostatin release and therefore the functionality of the CBs was immunohistologically shown. The protein diffusion was proven at a distance of up to 4 mm into the tumour-tissue. By means of the immunohistological staining of the von-Willebrand-Factor (vWF) and subsequent histomorphological detection the vascularization density within the GBM was examined. In this study for the first time significant (P<0,05) reductions of blood vessel density could be quantificated under conditions of Good-Laboratory-Practise (GLP) after implantation of Endostatin releasing stem cells. No significant reduction of tumour size could be shown. A prolongation of the examination period seems sensible to show the tumour suppressing effects following angiogenesis rejection. The absence of a correlation between vascularization density and tumour size was statistically marked down for this experiment (r² <0,8). The good biocompatibility and functionality of the CBs shows that the encapsulation of the active substance expressing stem cells with alginate leaves us with a wide spectrum for possible applications. Transparenchymal Endostatin diffusion far into the tumour-site, its high antiangiogenic potency and the reduction of neoangiogenesis in a rapidly growing experimental glioblastoma up to 80% was prevented. Hence a postoperative application within the resection cavity of GBM patients in order to prevent recrudescence considers possible.

Das Glioblastoma multiforme (GBM) hat eine Inzidenz von 4000 bis 5000 Neuerkrankungen pro Jahr. Trotz der Anwendung aller bekannten Therapien geht die Diagnose GBM mit einer infausten Prognose einher. Die mittlere Überlebenszeit liegt bei 12 bis 15 Monaten nach Diagnosestellung. Ein neuer Therapieansatz zur Bekämpfung des schnell wachsenden Tumors basiert auf antiangiogenen Mechanismen. Ziel ist es, das GBM durch die Unterdrückung der Neovaskularisierung einer Unterversorgung auszusetzen, um eine Wachstumshemmung und Nekrotisierung des Tumorgewebes zu erreichen. Endostatin, ein endogenes 22 kD großes Protein, ist ein gut verträglicher Angiogenesehemmer. Problematisch ist aber seine Verabreichung. Da das Protein eine sehr kurze Halbwertszeit hat und die Blut-Hirn-Schranke überwinden muss, sind durch systemische Gaben keine ausreichend hohen Konzentrationen des Proteins im Tumorgebiet erzielbar. Die Verwendung ex-vivo genmodifizierter Endostatin sezernierender humaner mesenchymaler Stammzellen (EMSC) ermöglicht eine dauerhafte Produktion des Proteins. Durch die Verkapselung solcher EMSC mit einer für Nährstoffe und Sauerstoff diffusionsdurchlässigen, aber gegen die Bestandteile der Empfängerabwehr abschirmenden Alginatmatrix, wird die intrazerebrale Implantation direkt am Zielort möglich. Alginat ist ein Alginsäure-Polymer aus marinen Braunalgen, das eine gute Biokompatibilität aufweist. Zur Herstellung der in dieser Arbeit implantierten CellBeads® (CBs) wurde ein Alginat mit einem hohen Guluronsäureanteil (High-G Alginate), das mit Bariumionen vernetzt war, verwendet. Ziel dieser Arbeit war es, ein GBM Modell zu standardisieren und daran die antiangiogene und tumorreduzierende Wirkung von mit Alginat zu CBs vertropften EMSC zu untersuchen. Für ein reproduzierbares experimentelles GBM wurden BDIX/Ztm-Ratten BT4Ca-Gliomzellen in die rechte Gehirnhemisphäre injiziert. Am Tag nach der Gliominokulation wurden den Tieren an zuvor entwickelten Koordinaten CBs intrazerebroventrikulär und gleichzeitig nahe dem GBM implantiert. Untersucht wurden eine Kontrollgruppe (nur BT4Ca), eine Gruppe mit leeren CBs (LCB), eine Gruppe mit Stammzellen ohne Endostatinsekretion (SCB) und eine Gruppe mit Endostatinbeads (ECB) jeweils nach 12 Tagen Versuchszeitraum. Die Implantate konnten histologisch intakt nachgewiesen werden und es zeigten sich keine immunologischen Reaktionen der Empfängertiere. Erstmalig konnte immunhistologisch die Endostatinfreisetzung und damit die Funktionalität der CBs sowie die intrazerebrale Diffusion des Proteins über eine Distanz von bis zu 4 mm in das Tumorgewebe gezeigt werden. Anhand einer immunhistologischen Färbung des von-Willebrand-Faktors (vWF) und anschließender Partikeldetektion wurde die Vaskularisierungsdichte innerhalb des experimentellen GBM untersucht. In einem intracraniellen GBM Modell konnte erstmalig eine signifikante Verringerung der Vaskularisierungsdichte (P<0,05) nach Implantation Endostatin sezernierender Stammzellen nachgewiesen und unter den Bedingungen der Good Laboratory Practice (GLP) quantifiziert werden. Es konnte keine signifikante Tumorreduktion gezeigt werden. Eine Verlängerung des Untersuchungszeitraumes erscheint sinnvoll, um eine tumorsupprimierende Wirkung als Folge der Blutgefäßreduktion zu zeigen. Das Fehlen der Korrelation zwischen Vaskularisierungsdichte und Tumorgröße wurde für diesen Versuch statistisch belegt (r²< 0,8). Die gute Biokompatibilität und Funktionalität der CBs zeigt, dass die Verkapselung von Wirkstoff sezernierenden Stammzellen mit Alginat ein breites Spektrum von denkbaren Anwendungsbereichen bietet. Endostatin diffundierte aus den CBs transparenchymal bis weit in den Tumorbereich hinein, wies eine große antiangiogene Potenz auf und war in der Lage, die Neoangiogenese im schnell wachsenden experimentellen Glioblastom um bis zu 80% zu reduzieren. Diese Ergebnisse machen eine postoperative Applikation in die Resektionshöhle bei GBM Patienten im Sinne einer Rezidivprävention denkbar.

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Kleinschmidt, Kerstin: Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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