Mapping quantitative trait loci (QTL) and comparative analysis of positional candidate genes for osteochondrosis in South German Coldblood horses

Wittwer, Catherine Elisabeth

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Mapping quantitative trait loci (QTL) and comparative analysis of positional candidate genes for osteochondrosis in South German Coldblood horses

German
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Ziel dieser Arbeit war es, bei heranwachsenden Süddeutschen Kaltblutpferden die Prävalenz für Osteochondrose (OC) und Osteochondrosis dissecans (OCD) in Fessel- und Sprunggelenken zu erfassen und die Heritabilität für dieses Merkmal zu schätzen. Eine molekulargenetische Analyse zur Identifikation von Merkmalsgenorten (QTL) für OC in Fessel- und Sprunggelenken wurde durchgeführt, um auf diesem Weg positionelle Kandidatengene zu identifizieren und mit Hilfe von intragenischen Einzelnukleotidaustauschen (SNPs) Markertests für OC zu entwickeln. Die Prävalenz von OC/OCD in Fessel- und Sprunggelenken und palmaren/plantaren isolierten Verschattungen (POFs) im Fesselgelenk wurde an einem Material von 167 Fohlen und Jährlingen mit einem durchschnittlichen Alter von 14 Monaten ermittelt. Von den untersuchten Tieren zeigten 62% einen OC-Befund und 27% der Pferde hatten eine isolierte röntgenologische Verschattung in einem der Gelenke. Die Heritabilität für das Vorkommen von OC, OCD und POFs wurde mit einem linearen Tiermodell mittels Residual Maximum Likelihood (REML) geschätzt. Dabei lag die Heritabilität für OC im Fesselgelenk bei h² = 0,16 und für OC im Sprunggelenk bei h² = 0,04. Zusätzlich zu den Befunden im Fesselgelenk wurde die Heritabilität für POFs geschätzt, wobei sich eine deutlich höhere Heritabilität von h² = 0,48 ergab. Im ersten Schritt des Genomscans wurden insgesamt 157 Mikrosatellitenmarker für neun Halbgeschwisterfamilien bestehend aus 215 Süddeutschen Kaltblutpferden genotypisiert. Die nicht-parametrische Kopplungsanalyse wurde unter Verwendung der Software MERLIN durchgeführt und basierte auf dem "identical-by-descent" (IBD) Verfahren. Als signifikant für die Kosegregation eines Markerallels mit dem Phänotyp OC gelten Irrtumswahrscheinlichkeiten (p) von 0,05 oder kleiner. In einem zweiten Schritt wurden zur Feinkartierung von potentiellen QTL 93 zusätzliche Mikrosatellitenmarker ausgewählt und an dem Familienmaterial genotypisiert. Signifikante QTL für Fesselgelenk OC/OCD und Sprunggelenk OC wurden auf 17 equinen Chromosomen lokalisiert, wobei sich die QTL für die einzelnen Merkmale auf unterschiedlichen Chromosomen befanden. Dies deutet daraufhin, dass unterschiedliche Gene auf verschiedenen Pferdechromosomen für die Entwicklung von OC bzw. OCD in den verschiedenen Gelenken verantwortlich sind. Zur weiteren Feinkartierung wurden der genomweit signifikante QTL auf ECA4 und der chromosomweit signifikante QTL auf ECA18 ausgewählt. Für eine 67 cM große Region auf ECA18, in der ein QTL für OC lokalisiert ist, wurde eine umfassende vergleichende 5,000-rad Radiation Hybrid (RH) Karte erstellt. Dafür wurden 44 Gene-assoziierte Marker und 16 Mikrosatellitenmarker aufgrund ihrer Position ausgewählt. Auf diese Weise konnte die Markerdichte der bisher publizierten komparativen Genkarten zwischen Mensch und Pferd deutlich erhöht und die Lokalisation der bereits kartierten Mikrosatellitenmarker zu den neu kartierten Genen ermittelt werden. Im nächsten Schritt wurden 67 SNP-Marker in 18 von den kartierten Genen entwickelt. Diese SNPs waren größtenteils informativ im vorliegenden Familienmaterial und bestätigten in der Kopplungsanalyse die Lokalisation des QTL auf Chromosom 18 deutlich und grenzten ihn auf einen Bereich von 31.0 cM bis 56.1 cM ein. Jeweils zwei SNPs im GALNT13, CMYA3 und ACVR1 Gen waren mit OC im Fesselgelenk assoziiert. Betrachtet man den Phänotyp OCD im Fesselgelenk, so waren vier SNPs im CMYA3 Gen signifikant assoziiert und einer von diesen SNPs war ebenfalls mit OC im Sprunggelenk assoziiert. Auf ECA4q wurde ein chromosomweit signifikanter QTL für OCD im Fesselgelenk bei vier Halbgeschwisterfamilien im Bereich von 70.0 cM bis 73.3 cM lokalisiert. Insgesamt wurden in dieser Region 22 SNPs und ein Mikrosatellitenmarker in sechs Kandidatengenen entwickelt und zur Feinkartierung des QTL verwendet. Ein SNP im AOAH Gen bestätigte in der Kopplungsanalyse die Lokalisation des QTL bei 72.2 cM. Für die Assoziationsstudie wurden 32 Pferde, die OCD im Fesselgelenk hatten und 64 gesunde Pferde verwendet. Dabei zeigte ein intragenischer SNP im AOAH Gen einen signifikanten additiv genetischen Effekt und einen signifikanten Dominanzeffekt. Pferde mit dem Genotyp homozygot G>G waren von OCD im Fesselgelenk betroffen und die gesunden Tiere hatten vornehmlich die Genotypen A>A oder A>G. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Genorte auf ECA4q und ECA18 Gene beherbergen, die an der Entstehung der Osteochondrose beteiligt sind. Die Feinkartierung dieser zwei QTL war ein erster Schritt im Hinblick auf die Identifizierung von für Osteochondrose verantwortlichen Genen. Ein intragenischer SNP-Marker im AOAH Gen auf ECA4q zeigte ein populationsübergreifendes Kopplungsungleichgewicht für das Merkmal OCD im Fesselgelenk, und scheint somit ein brauchbarer Marker für dieses Merkmal bei Süddeutschen Kaltblutpferden zu sein.

The aim of this work was to quantify the factors associated with the prevalence of radiological signs of osteochondrosis (OC) and osteochondrosis dissecans (OCD) in fetlock and hock joints of young South German Coldblood (SGC) horses and to estimate the heritability for this condition. Subsequently, a whole genome scan was performed to identify quantitative trait loci (QTL) for equine OC/OCD in order to find positional candidate genes for this disease and to develop a genetic test based on single nucleotide polymorphisms (SNPs). The prevalence of radiological signs of OC/OCD in fetlock and hock joints and separately palmar/plantar osseous fragments (POFs) in fetlock joints was analysed in 167 young SGC horses with a mean age of 14 months. The presence of at least one osteochondrotic lesion in fetlock or hock joints was documented for 62 % of the horses and 27 % of the horses had osseous fragments. Heritabilities were estimated for these radiological signs using Residual Maximum Likelihood (REML) under a linear animal model with an estimate of h² = 0.16 for OC in fetlock joints, h² = 0.04 in hock joints, and h² = 0.48 for POFs. In the first step of the whole genome scan 157 microsatellite markers were genotyped using nine paternal half-sib families including 215 SGC horses. A non-parametric linkage analyses based on identical by descent (IBD) mapping was performed to identify QTL for the presence of signs of OC in fetlock and hock joints, fetlock OC, hock OC, fetlock OCD, and POFs in fetlock joints with nominal error probabilities for LOD scores or Zmeans ≤ 0.05. In a second step additionally 93 markers were genotyped to refine the putative QTL on 17 equine chromosomes (ECA). QTL for fetlock OC/OCD and hock OC were mostly mapped on different chromosomes indicating that these traits may be inherited independently. Due to the high number of QTL found for OC and OCD, the genome-wide QTL located on ECA4 and a chromosome-wide QTL located on ECA18 were chosen for further refinement. A comprehensive 5,000-rad radiation hybrid (RH) map of a 67 cM region on ECA18 harbouring QTL for equine OC was constructed including 16 microsatellite markers and 44 gene-associated sequence tagged site (STS) markers. Breakpoint resolution in the human-equine comparative map was considerably improved by discovering three blocks of conserved synteny between horse and man with two chromosomal breakpoints in the segment of ECA18. Furthermore, 67 new SNP-markers located in 18 of the mapped genes of ECA18 were developed. After including these SNPs into the linkage study, the QTL for OC on ECA18 could be confirmed and narrowed down to an interval between 31 and 56.1 cM. Two SNPs in GALNT13, two SNPs in ACVR1, and two SNPs in CMYA3 were significantly associated with fetlock OC. Regarding osseous fragments in fetlock joints four SNPs in the CMYA3 gene were associated and one of these SNPs was as well associated with hock OC. On ECA4q, a chromosome-wide significant QTL for fetlock OCD was found in four half-sib families at a relative position of 70.0-73.3 cM. A total of 22 SNPs and a microsatellite marker were developed in six candidate genes in this region and used to refine the putative QTL. After including these SNPs in the linkage study, one SNP in the AOAH gene affirmed the linkage for fetlock OCD at 72.2 cM. For association analyses 32 affected and 64 unaffected horses were genotyped for all SNPs identified. Here a SNP in the AOAH gene showed an additive genetic and significant dominance effect for fetlock OCD. All homozygous G>G horses were affected with fetlock OCD and unaffected horses were predominantly homozygous A>A or heterozygous A>G. These results indicate that genes involved in the development of OC are located on ECA4q and ECA18. The refinement of the two QTL found for OC was a first step towards the identification of genes responsible for equine OC. An intragenic SNP marker of the AOAH gene on ECA4q showed a population-wide linkage disequilibrium for the trait fetlock OCD, and appeared as a suitable OCD marker in SGC horses.