Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Optimierung und Nutzung eines Reportergenassays für die Bestimmung östrogener Aktivität in Futtermitteln für Schweine unter besonderer Berücksichtigung der Phytoöstrogene aus Soja

Winter, Petra Maria

There is considerable evidence to show that exogenous estrogenic compounds, such as phytoestrogens, can have an adverse effect on fertility. Impaired fertility in sows may be the result of feeding materials such as soya beans that contain phytoestrogens such as the isoflavones, genistein and daidzein. Thus, the aims of the current study were two-fold: 1. to improve an established luciferase assay for the measurement of estrogenic activity (KLUCZKA 2003) and then, to validate the modified assay using HPLC; 2. to use the modified assay to measure estrogenically-active compounds in feedstuffs for sows and colostrum taken from sows and to investigate whether the phytoestrogens, genistein and daidzein, together with estradiol had any additive or potentiating eestrogenic effects. The bioassay used in the study was a reportergene assay (luciferase assay) based on stable transfected human embryonic kidney (HEK) cells. The estrogenic activity measurd by the luciferase assay was expressed in estradiol-equivalents (EEQ). Part 1 - Summary results arising from the improvement of the luciferase assay: Most notably surface coating with dry collagen and adjustment to protein content (cell numbers) in the assay reduced variation of the results. Enzymatic treatment of samples converted phytoestrogens into free aglycones and allowed measuring of samples by bioassay and HPLC at the same time. Part 2 – Summary results concerning measurement of estrogenically-active substances: The combined effect of the phytoestrogens genistein and daidzein was tested with regard to potentiating estrogenic effects. Additionally, different concentrations of these substances were tested together with estradiol. Simple additive effects were measured. Feed for lactating sows were analysed for estrogenically-active compounds using the modified assay and HPLC. Samples of feed given to lactating sows that were sent to the Institute of Animal Nutrition, were sometimes associated with herds where altered fertility was reported. In addition, feed samples with low concentration of isoflavones were measured. The feedstuffs analysed contained < 5 µg zearalenone/kg FM so these “zearalenone-free” samples were compared with a few “zearalenone-loaded” samples containing > 50 µg zearalenone/kg FM. The estrogenic activity measured in diets fed to sows in herds with altered fertility was ~276 µg EEQ/kg FM (alpha HEK) and ~295 µg EEQ/kg FM (beta HEK). The estrogenic activity measured in sow feeds from farms without any fertility problems was lower. In the current study the estrogenic activity in feed was much higher (1.7 x 102 fold) as compared to the EEQ-values in the study of KLUCZKA 2003 (feed samples from farms with hyperestrogenism and without hyperestrogenism). These differences in the estrogenic activity were probably caused by converting the bound isoflavones to free aglycones by effective enzymatic treatment. Examination of the EEQ‑values (genistein and daidzein) showed that the estrogenic activity was mainly based on the availability of the isoflavones. However, there were also samples with high estrogenic activity that was not associated with the isoflavone content. Further investigations are necessary in order to clarify the relationship between phytooestrogen and zearalenone content of a feed and its estrogenic activity. In this context, the estrogenic activity in zearalenone-positive samples could only be partly explained by the efficiency of genistein and daidzein. Zearalenone in the feed was associated with estrogenic activity which had similar effects as those caused by high isoflavone concentrations (20 % soy). Colostrum samples were collected from sows either fed a phytoestrogen-enriched diet (the last seven days of pregnancy) or a control diet nearly free of phytoestrogens (KARALJOV, doctoral thesis in prep.). Estrogenic activity in the colostrum was similar between control sows and those fed an isoflavone-enriched diet. However, HPLC analysis indicated that, genistein and daidzein concentrations were about 2.5 times lower in control sow colostrum compared to that from sows fed the isoflavone-enriched feed. Conclusions: When measuring estrogenically-active substances in feeds, it is important to consider the effects of all substances present and their combined effect. The modified assay was suitable for feedstuff screening. Clinically relevant zearalenone concentrations displayed estrogenic effects that did not differ from those resulting from high isoflavone concentrations. The bioassay has limited application as a screening tool for zearalenone because EEQ-values < 100 ‑ 50 µg/kg FM may still be clinically relevant. Results obtained with zearalenone show that clinical relevance can not be deduced by measuring estrogenic activity alone in vitro; for example sows are more sensitive to zearalenone and it´s important to consider the different metabolism of substances. Isoflavone intakes by sows cannot be confirmed on the basis of colostral analysis using the luciferase assay; the endogenous production of hormones masks the effects of exogenous hormones (e.g. phytoestrogens).

Da exogene Estrogene nachteilige Effekte auf die Fruchtbarkeit entfalten können, stellte sich die Frage, ob nicht auch natürlich vorkommende estrogenartig wirkende Substanzen wie die Phytoestrogene ursächlich für Fruchtbarkeitsstörungen bei Sauen sein könnten. Diese Arbeit fokussierte sich auf den Nachweis der estrogenen Aktivität in Futtermitteln für Sauen, wobei die Effekte der Isoflavone Genistein und Daidzein aus Soja besonders berücksichtigt wurden. Ziel war es, einen in der Studie KLUCZKA (2003) eingesetzten Bioassay zu optimieren und mittels der HPLC zu validieren. Der verbesserte Assay wurde für Analysen von Futtermittelproben und Sauenmilch verwendet und es erfolgten Untersuchungen zu Kombinationswirkungen von Genistein, Daidzein und 17-ß- Estradiol. Der verwendete Bioassay war ein Reportergenassay (Luciferase-assay) auf der Basis von stabil transfizierten human embroynal kidney (HEK) Zellen, mit dessen Hilfe die estrogene Aktivität in Form von Estradiol-Equivalenten (EEQ) bestimmt werden konnte Ergebnisse der Optimierungsmaßnahmen lassen sich wie folgt zusammenfassen (Teil 1): Vor allem die Beschichtung der Well-Platten mit getrocknetem Kollagen sowie die Berück-sichtigung unterschiedlicher Zellzahlen pro Well führten zu signifikant geringeren Variationen der Messwerte. Der Enzymeinsatz in der Probenvorbereitung führte bei den Futtermitteln zu einer nahezu vollständigen Phytoestrogenkonversion in freie Aglykone und ermöglichte die parallele Untersuchung mittels Luciferaseassay und HPLC. Ergebnisse der Untersuchungen mittels optimierten Reportergenassay und HPLC (Teil 2): Kombinationswirkungen von Genistein mit Daidzein und von Genistein und Daidzein mit Estradiol wurden geprüft. In allen Fällen unterschieden sich die Kombinationseffekte nicht signifikant von den kalkulatorisch erwarteten Effekten aus der Additon der Einzelwirkungen (p = n. s). Es folgte die Untersuchung von Mischfuttermitteln für Schweine aus vorberichtlich belasteten Beständen (Fertilitätsstörungen) und von Proben ohne negativen Vorbericht. Die Futtermittelproben enthielten nachweislich Zearalenon unter 5 µg/kg uS; zum Vergleich wurden exemplarisch Proben mit einer erhöhten Zearalenonkonzentration (> 50 µg/kg) untersucht. Futtermittelproben aus Betrieben mit Fertilitätsstörungen zeigten durchschnittliche estrogene Wirkungen von 276 µg EEQ/kg uS (alpha HEK) und 295 µg EEQ/kg uS (beta HEK). Die estrogene Aktivität in Futtermitteln aus Betrieben ohne negativen Vorbericht war niedriger. Der Vergleich estrogener Aktivität in Futtermitteln aus Betrieben mit und ohne Hyperestrogenismus (Studie von KLUCZKA 2003) zeigte z.T. um den Faktor 1,7 x 102 höhere EEQ-Werte in der vorliegenden Studie. Dies ist auf die in dieser Arbeit durchgeführten enzymatischen Phytoestrogenkonversionen in freie Aglykone zurückzuführen. Korrelationsuntersuchungen der EEQ-Werte zu Genistein- und Daidzeingehalten (HPLC) zeigten, dass die estrogene Aktivität nahezu vollständig durch die Wirkung der Isoflavone bedingt wurde. Unerwartet hohe estrogene Aktivität in Proben, die nicht mit den Isoflavongehalten korrelierten, erfordern weiterführende Untersuchungen zur Abklärung (eventuell Vorhandensein anderer Phyto-estrogene oder erhöhte Zearalenongehalte). Generell waren die Zearalenongehalte mit estrogenen Effekten verbunden, die sich im Niveau aber nicht wesentlich von Wirkungen sehr hoher Isoflavon-gehalte (bis 20 % Sojaanteil) unterschieden. Untersuchte Kolostrumproben stammten aus einem Fütterungsversuch, in dem tragende Sauen vor dem Abferkeln über sieben Tage ein phytoestrogen-angereichertes Futter erhielten (KARALJOV, Dissertation in prep.). Das Kolostrum zeigte im Bioassay keine signifikanten Unterschiede zwischen den durchschnittlichen EEQ-Gehalten der Proben von Kontroll- und Versuchstieren. Die estrogene Aktivität variierte auf nahezu einem Niveau und war vermutlich auf den endogenen Hormonspiegel zurückzuführen. Mittels HPLC gemessene Gesamtgehalte an Genistein und Daidzein in den Kolostrumproben der Kontrolltiere waren im Vergleich zu denen der Versuchsgruppe durchschnittlich um den Faktor 2,5 niedriger. Schlussfolgerungen: Bei der Untersuchung estrogen aktiver Substanzen sollte eine Kombinations-wirkung der Stoffe berücksichtigt und zumindest eine additive Wirkung in Betracht gezogen werden. Der optimierte Bioassay eignet sich für die Untersuchung von Futtermitteln für Schweine als ein geeignetes Screeningverfahren; für Zearalenon erscheint er nur jedoch eingeschränkt anwendbar. Klinisch relevante Zearalenonbelastungen zeigten im Bioassay estrogene Wirkungen, die sich nicht wesentlich von estrogenen Effekten hoher Isoflavonbelastungen unterschieden. Aus vergleichbaren estrogenen Aktivitäten in vitro ist die klinische Bedeutung nicht ableitbar. Empfindlichkeiten der Tierspezies und Vorgänge im Organismus müssen berücksichtigt werden. Die Untersuchung der Kolostrumproben mittels Bioassay erlaubt keine Rückschlüsse auf vorherige Isoflavonaufnahmen; endogene Hormone „überlagern“ deren Wirkung.

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Winter, Petra Maria: Untersuchungen zur Optimierung und Nutzung eines Reportergenassays für die Bestimmung östrogener Aktivität in Futtermitteln für Schweine unter besonderer Berücksichtigung der Phytoöstrogene aus Soja. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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