Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

DIVA vaccine development against Actinobacillus pleuropneumoniae infection

Maas, Alexander

Actinobacillus pleuropneumoniae is the causative agent of porcine pleuropneumonia which leads to high economic losses in the swine industry worldwide. Vaccination against this pathogen is hampered by the occurrence of 15 serotypes, and commonly used whole cell bacterin vaccines are not sufficiently cross-serotype protective. In addition, for generating and maintaining specified pathogen-free herds it is desirable to use DIVA (differentiating infected from vaccinated animals) vaccines. Thus, we embarked on two different strategies to develop DIVA vaccines inducing reliable cross-serotype protection. The first strategy is based on a detergent wash extraction of outer membraneassociated and secreted proteins which we developed into a DIVA vaccine using the immunogenic ApxII toxin present in 13 of the 15 A. pleuropneumoniae serotypes as the DIVA antigen. The apxIIA gene was deleted in each of the vaccine strains (A. pleuropneumoniae serotypes 1, 2, and 5) using a single-step Transconjugation system, and equal parts of detergent washes from these strains served as the vaccine antigen. After intramuscular immunisation all pigs developed a strong humoral immune response to the vaccine antigen and showed no reactivity in an ApxIIA-ELISA. Upon challenge, all pigs were completely protected from clinical symptoms in trials with a homologous (serotype 2) as well as with a heterologous strain (serotype 9); in addition, colonisation of the challenge strain was clearly reduced though not abolished completely. As a result of the highly efficient protection, however, immunised pigs did not develop antibodies to the DIVA-antigen at levels detectable by ELISA but only by a more sensitive Western blotting approach, thereby demonstrating the challenge in developing appropriate marker vaccines for the livestock industry. In order to identify the main immunogenic antigens and standardize the vaccine components, two dimensional gel electrophoresis with subsequent Western Blot analysis in combination with quadropol time-of-flight mass spectrometry was employed. We identified five different proteins. Among these proteins was the ApxIV toxin, which was described to be expressed only in vivo. Since pigs surviving natural infection are at least partially protected from clinical symptoms upon reinfection with any serotype, in our second strategy we set out to construct an attenuated A. pleuropneumoniae live vaccine allowing the differentiation of vaccinated from infected animals by successively deleting virulence-associated genes. Based on an A. pleuropneumoniae serotype 2 prototype live negative marker vaccine, genes encoding enzymes involved in anaerobic respiration and the ferric uptake regulator Fur were deleted resulting in a highly attenuated 6-fold mutant; this mutant was still able to colonize the lower respiratory tract and induced a detectable immune response. Upon a single aerosol application, this mutant provided significant protection from clinical symptoms upon heterologous infection with an antigenically distinct A. pleuropneumoniae serotype 9 challenge strain and allowed the serological discrimination between infected and vaccinated groups. Since a practical application system is necessary for a potential future use of the vaccine in the field, the protective efficacy of the 6-fold mutant upon single intramuscular or intranasal injection was tested. Both application routes were shown to induce a protective immunity against challenge with A. pleuropneumoniae serotype 7, but only the intranasal application caused no adverse effects and still mediated a highly protective immune response upon challenge with a heterologous serotype.

Actinobacillus pleuropneumoniae ist der Erreger der Pleuropneumonie der Schweine, die weltweit zu hohen wirtschaftlichen Verlusten in der Schweinehaltung führt. Eine Impfung gegen dieses Pathogen wird durch das Vorkommen von 15 verschiedenen Serotypen erschwert und zur Zeit gebräuchliche Bakterinimpfstoffe schützen nicht ausreichend serotypübergreifend. Außerdem ist es für die Erzeugung und Erhaltung von spezifisch pathogen-freien Beständen wünschenswert, Impfstoffe zu nutzen, die eine Unterscheidung von geimpften und infizierten Tieren ermöglichen (DIVA Impfstoffe, Differentiation of infected and vaccinated animals). Wir haben daher zwei verschiedene Strategien verfolgt um DIVA Impfstoffe zu entwickeln, die einen zuverlässigen serotypübergreifenden Schutz erzeugen. Die erste Strategie gründet auf einer Detergenzextraktion von äußeren Membranassoziierten und sezernierten Proteinen, die wir in einen DIVA Impfstoff weiterentwickelt haben. Dabei dient das ApxII-Toxin, das in 13 von 15 A. pleuropneumoniae Serotypen vorhanden ist, als DIVA-Antigen. Das apxIIA Gen wurde in jedem der Impfstoffstämme (A. pleuropneumoniae Serotypen 1, 2 und 5) mit Hilfe des „Single-Step“ Transkonjugationssystems zerstört, und gleiche Anteile der Detergenzextraktionen dieser Stämme dienten anschließend als Impfstoffantigen. Nach intramuskulärer Immunisierung entwickelten alle Schweine eine starke humorale Immunantwort gegenüber den Impfstoffantigenen und zeigten keinerlei Reaktion im ApxIIA-ELISA. Bei Belastung mit einem homologen (Serotyp 2) oder einem heterologen (Serotyp 9) waren alle Schweine komplett gegen klinische Symptome geschützt; zusätzlich war die Kolonisierung durch die Belastungsstämme deutlich reduziert, wenn auch nicht ganz unterbunden. Als ein Resultat der sehr guten Schutzwirkung des Impfstoffes entwickelten die geimpften Schweine zwar Antikörper gegen das ApxII-Toxin, die aber nicht mit dem ELISA, sondern nur mit dem sensitiveren Western Blot nachgewiesen werden konnten. Genau dieses Verhältnis von ausreichendem Schutz, aber dennoch Unterscheidung von geimpften und geimpften plus infizierten Tieren stellt eine der Herausforderungen der Markerimpfstoffentwicklung dar. Zur Identifizierung der hauptsächlich vorhandenen Immunogene und zur Standardisierung der Inhaltsstoffe wurde eine zweidimensionale Gelelektrophorese in Kombination mit einer Quadrupol „time-of-flight“ Massenspektrometrie eingesetzt. Dabei haben wir fünf verschiedene Proteine identifiziert. Unter diesen Proteinen war auch das ApxIV-Toxin, das bisher nur als in vivo exprimiert beschrieben wurde. Aufgrund der Tatsache, dass Schweine, die eine natürliche Infektion überstanden haben, anschließend zumindest teilweise gegen klinische Erscheinungen bei Reinfektion mit irgendeinem anderen Serotyp geschützt sind, haben wir in unserer zweiten Strategie versucht, einen A. pleuropneumoniae DIVA Lebendimpfstoff zu entwickeln. Dabei wurden schrittweise virulenz-assoziierte Gene ausgeschaltet. Auf Basis eines A. pleuropneumoniae-Serotyp-2-Prototyp-Lebend-Negativ-Markerimpfstoffes wurde durch Deletion von Genen, die für Enzyme des anaeroben Stoffwechsels sowie für den Eisenaufnahmeregulator Fur kodieren, eine stark attenuierte 6fach Mutante erzeugt. Diese Mutante ist immer noch in der Lage, den unteren Atemtrakt zu kolonisieren und eine zuverlässige, nachweisbare Immunantwort zu induzieren. Nach einmaliger Aerosolapplikation bietet sie einen signifikanten Schutz vor klinischer Erkrankung nach heterologer Belastung mit einem antigenetisch stark unterschiedlichen Serotyp 9 Stamm. Außerdem erlaubt diese Mutante eine serologische Unterscheidung zwischen infizierten und geimpften Gruppen. Da für eine spätere Nutzung in der Praxis eine praktikable Applikationsform notwendig ist, wurde die protektive Wirkung der 6fach Mutante nach einmaliger intramuskulärer oder intranasaler Injektion untersucht. Beide Applikationsrouten waren in der Lage eine schützende Immunität gegen Infektionen mit A. pleuropneumoniae Serotyp 7 zu induzieren, aber nur die intranasale Immunisierung verursachte keine Nebenwirkungen und vermittelte dennoch einen hohen Immunschutz gegenüber Infektion mit einem heterologen Serotyp.

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Maas, Alexander: DIVA vaccine development against Actinobacillus pleuropneumoniae infection. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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