Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Development of a DIVA vaccine against Salmonella Typhimurium infection

Selke, Martin

Salmonella (S.) Typhimurium, as a nontyphoidal S. species, is a common causative agent of bacterial food-borne disease worldwide. Especially strains of S. Typhimurium DT104, a phage type carrying multiple antibiotic resistances, poses a serious challenge to consumer protection. In 1998 the adoption of a national guideline for the reduction of Salmonella entry into the food chain in Germany led to the installation of a voluntary Salmonella surveillance system, which is based on the serological analysis of meat-juice samples taken at the slaughterhouse. Thus, participating pig production facilities are classified according to their Salmonella seroprevalence into categories I to III). Furthermore, facilities with high seroprevalence have to take veterinary-assisted measures to improve their Salmonella status; in case of a category III classification these measures are accompanied by a general inspection of the facilities to determine the source of pathogen entry. Vaccination of weaning pigs with the licensed vaccine Salmoporc® leads to a reduction in colonization of the porcine intestinal tract and, thus, could be a helpful tool in reducing Salmonella prevalence. However, the vaccinated pigs are serologically indistinguishable from pigs infected with virulent field-strains and, thus, vaccination would not improve the classification of a herd. In this study we developed a DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) vaccine against S. Typhimurium, based on the licensed vaccine Salmoporc® by introducing a negative marker via genetic exchange. The OmpD protein, a major porin of the outer membrane, was identified as a suitable marker by 2D PAGE followed by Western immunoblot and mass spectrometry. Subsequently, the ompD gene was deleted from the bacterial chromosome. The ompD deficient mutant showed no significant difference to the parent strain with respect to virulence in Balb/c mice, and provided protection to experimentally challenged pigs. A DIVA vaccine always requires a serological test able to detect the difference in antibody pattern caused by the selectable marker. In this study two ELISA-based systems were developed which allow the detection of anti-OmpD antibodies. One system was based on a recombinant GST-OmpD fusion protein as solid phase antigen, but the differentiation between infected and vaccinated with this system was not satisfactory. Therefore, a peptide spot array analysis of the OmpD protein was performed, and four immunogenic epitopes, were identified. One of these epitopes was successfully used as solid phase antigen in an ELISA to differentiate sera of infected and vaccinated animals. The DIVA vaccine developed in this study, in association with the peptide-based ELISA, allows, for the first time, to improve the Salmonella status of pig herds by vaccination without affecting the seroprevalence of the vaccinated herds.

Salmonella (S.) Typhimurium ist unter dem Gesichtspunkt des Verbraucherschutzes einer der wichtigsten Erreger von Zoonosen weltweit und in der Schweineindustrie das vorherrschende Serovar. Das vermehrte Auftreten multi-resistenter Erreger, (zumeist Phagentyp DT104) führte 1998 zur Verabschiedung der „Leitlinien für ein Programm zur Reduzierung des Eintrags von Salmonellen durch Schlachtschweine in die Fleischgewinnung“. Hiermit verbunden war die Einrichtung eines serologischen Überwachungssystems auf Fleischsaft-Basis, durch das Schweine-produzierende Betriebe nach Seroprävalenz in drei Kategorien eingeteilt werden. Betriebe mit hoher Seroprävalenz müssen veterinärmedizinisch begleitete Maßnahmen ergreifen, um ihren Salmonellenstatus zu verbessern. Die Impfung von Absatzferkeln mit der Lebend-Vakzine Salmoporc® führt zu einer deutlichen Minderung der Kolonisierung des porcinen Intestinaltrakts und könnte ein wirksames Mittel zur Reduktion des Salmonelleneintrags sein, sofern der Impfstamm serologisch von virulenten Feldstämmen unterscheidbar wäre. Ein solcher Impfstoff, der aufgrund eines Negativmarkers (also des Fehlens eines immunogenen Bestandteils im Erreger) die Unterscheidung von geimpften und infizierten Tieren erlaubt, wird als DIVA Vakzine (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des zugelassenen Impfstoffes Salmoporc® durch genomischen Austausch ein derartiger DIVA Impfstoff konstruiert. Als geeigneter Negativmarker wurde durch zweidimensionale Gelelektrophorese mit nachfolgendem Western Blot und Massenspektrometrie das immunogene Porin OmpD, ein prominentes Protein der äußeren Membran, identifiziert. Das für dieses Protein kodierende Gen wurde anschließend aus dem Chromosom des Salmoporc® Impfstoffes deletiert. Die ompD defiziente Mutante zeigte, abgesehen von der Markerfunktion, keine signifikanten Unterschiede zum Ausgangsstamm - weder in der Virulenzprüfung in Balb/c Mäusen noch in der Prüfung der protektiven Eigenschaften im Belastungsversuch im Schwein. Zu einem DIVA Impfstoff gehört immer ein diagnostisches Testsystem zur Unterscheidung des Impfstammes von Feldstämmen. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei ELISA-basierte Systeme entwickelt, die es ermöglichen, Antikörper gegen das OmpD Protein nachzuweisen. Das erste System, das auf dem kompletten rekombinanten Protein basierte, ließ keine ausreichende Diskriminierung zu (mangelnde Spezifität). Daraufhin wurde eine Epitopanalyse mithilfe von Peptidarrays durchgeführt. Eines von vier auf diese Weise identifizierten kontinuierlichen immunogenen Epitopen zeigte eine ausreichende Diskriminierung in der Reaktion mit Seren von geimpften und infizierten Tieren. Der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte DIVA Impfstamm bietet - in Verbindung mit dem ebenfalls entwickelten ELISA-Testsystem - erstmalig die Möglichkeit, den Salmonellenstatus in Schweinebeständen durch Impfung der Tiere nachhaltig zu verbessern ohne dass die Gefahr einer impfungsbedingten Erhöhung der Seroprävalenz besteht.

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Selke, Martin: Development of a DIVA vaccine against Salmonella Typhimurium infection. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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