Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen über die Eignung durchflusszytometrischer Testverfahren zur Beurteilung der Fertilität kryokonservierten Bullenspermas

Baarz, Dagmar

Aim of the present study was to evaluate various flow cytometric methods to be applied on cryopreserved bovine semen in order to assess whether they allowed a precise statement considering the bulls’ fertility. Therefore, quality parameters such as plasma membrane integrity, acrosomal status, mitochondrial membrane potential, integrity of the chromatin structure, intracellular concentration of calcium, reactive oxygen species and lipid peroxidation of 3 to 7 ejaculates of a total of 34 bulls were evaluated by using fluorochromes and flow cytometry. Besides the assessment directly after thawing, the samples were incubated at 37°C for 3 hours, in some assays even for 6 hours to compare the variation between the results. In order to check whether there are correlations to fertility, individual non-return rates on day 56 (NRR56) on the basis of 28.219 artificial inseminations ranging between 51,0 and 70,2 % (mean: 62,4 ± 5,1 %) were used.   Results obtained by flow cytometry are well reproducible. The examination of two different straws of the same ejaculate on two following days carried out independently showed high correlations (r ³ 0,87; p < 0,05). The intra-class correlation coefficients ranged between 0,75 and 0,98.   No or only low correlations (0,33 £ r £ 0,52 and -0,68 £ r £ -0,31, respectively; p < 0,05) were found between the results provided by the different tests directly after thawing. Relations did not change significantly during incubation (0,32 £ r £ 0,41 and -0,59 £ r £ -0,37, respectively; p < 0,05). Variation of results was comparingly high (11,54 % to 50,39 %). For plasma membrane integrity and acrosomal status, the ejaculate-related influence on the variation of results was predominant while for all other sperm traits, the individual influence was higher.   The results within the various assays after different time of incubation were highly correlated (0,63 £ r £ 0,98; p < 0,001) which changed by using either calcium-ionophore A23187 or H2O2 for some assays in order to stimulate the sperm trait in question: the relationship decreased between plasma membrane integrity measured directly after thawing and after three hours of incubation using the calcium-ionophore (r = 0,30; p > 0,05) as well as between acrosomal status measured directly or three hours after thawing and sperm with stimulated acrosome reaction by calcium-ionophore after three hours of incubation (r = 0,25 and 0,32 respectively; p > 0,05). In addition, the intensity of DHR fluorescence measured directly after thawing with and without use of H2O2 showed no correlation (r = 0,11; p > 0,05).   Furthermore, only moderate correlations were observed between NRR56 and the percentage of semen with high mitochondrial menbrane potential (r = 0,40; p < 0,05) and of semen with high intracellular concentration of calcium (r = -0,39; p < 0,05), both examined directly after thawing, as well as between NRR56 and the percentage of sperms with acrosome damage (r = 0,44; p < 0,01) and of DFI-sperm (r = -0,31; p < 0,08) measured after three hours of incubation. A multivariate analysis was calculated including all parameters in correlation to NRR56 meeting the significancy level of 0,15. The results showed that an overall view of those sperm traits allowed a good, reliable prediction of the individual fertility (b = 0,66; p < 0,0001).   Due to the results of this study it can therefore be stated that the flow cytometric examination of cryopreserved bovine semen allows a better assessment of fertility than conventional methods.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene durchflusszytometrische Testverfahren an tiefgefrorenem Bullensperma dahingehend zu überprüfen, ob sie eine präzise Aussage bezüglich der zu erwartenden Befruchtungsleistung des Bullen zulassen. Zu diesem Zweck wurden die Spermaqualitätsparameter Plasmamembranintegrität, akrosomaler Status, Mitochondrienmembranpotential, Integrität der Spermachromatinstruktur, intrazellulärer Calciumgehalt, reaktive Sauerstoffspezies und Lipidperoxidation an 3 bis 7 Ejakulaten von insgesamt 34 Bullen der Rassen Holstein Friesian und Red Holstein durchflusszytometrisch mittels verschiedener Fluorochrome bestimmt. Neben der direkt nach dem Auftauen der Samenprobe durchgeführten Untersuchung wurde das Sperma für 3, zum Teil auch für 6 Stunden bei 37°C inkubiert und die Resultate untereinander verglichen. Zur Überprüfung möglicher Korrelationen zwischen den Testergebnissen und der Fertilität standen für alle Bullen die auf der Basis von insgesamt 28.219 künstlichen Besamungen berechneten Non-Return-Raten am Tag 56 (NRR56) zur Verfügung, die zwischen 51,0 % und 70,2 % bei einem Mittelwert von 62,4 ± 5,1 % differierten.   Die durchflusszytometrisch erhobenen Qualitätsparameter waren gut reproduzierbar. Zwischen den Ergebnissen zweier unabhängig voneinander durchgeführter Messungen von 2 verschiedenen Pailletten eines Ejakulats an zwei aufeinander folgenden Tagen bestanden hochgradige Korrelationen (r ³ 0,87; p < 0,05 bzw. 0,0001). Die ermittelten Intra-Class-Korrelationskoeffizienten lagen zwischen 0,75 und 0,98. Zwischen den durchflusszytometrischen Tests bestanden unmittelbar nach dem Auftauen keine oder lediglich gering- bis mittelgradige Korrelationen (0,33 £ r £ 0,52 bzw. -0,68 £ r £ -0,31; p < 0,05), die sich nach drei- bzw. sechsstündiger Inkubation nicht wesentlich veränderten (0,32 £ r £ 0,41 bzw. -0,59 £ r £ -0,37; p < 0,05). Die relative Variabilität der einzelnen Testergebnisse war mit 11,54 % bis 50,39 % relativ hoch. Im Falle plasmamembranintakter Spermien und Spermien mit positivem akrosomalem Status überwog der ejakulatbedingte, bei allen anderen Assays der individuelle Einfluss auf die Ergebnisvariation.   Innerhalb der Assays waren mittel- bis hochgradigen Zusammenhänge (0,63 £ r £ 0,98; p < 0,001) zwischen den Testergebnissen zu verzeichnen, die nach unterschiedlich langer Inkubation ermittelt worden waren. Die Verwendung von Stimulantien beeinflusste diese Korrelationen: weder plasmamembranintakte Spermien direkt nach dem Auftauen   (r = 0,30; p > 0,05) noch Spermien mit positivem akrosomalem Status 0 und 3 Stunden nach dem Auftauen (r = 0,25 bzw. r = 0,32; p > 0,05) korrelierten mit dem entsprechenden, mit Calcium-Ionophor A23187 stimulierten 3h-Wert. Außerdem stand die unmittelbar nach dem Auftauen ermittelte DHR-Fluoreszenzintensität mit Zusatz von H2O2 in keinem Zusammenhang zum unstimulierten Wert (r = 0,11; p > 0,05).   Geringgradige Zusammenhänge bestanden zwischen NNR56 und Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (r = 0,40; p < 0,05) bzw. plasmamembranintakten Spermien mit hohem intrazellulärem Calciumgehalt (r = -0,39; p < 0,05), jeweils direkt nach dem Auftauen. Nach dreistündiger Inkubation korrelierten sowohl der ermittelte Anteil von Spermien mit positivem akrosomalem Status (r = 0,44; p < 0,01) als auch von DFI-Spermien (r = -0,31; p < 0,08) geringgradig mit der NRR56. Aus einer multivariaten Analyse aller in Korrelation zur NRR56 stehender Parameter ergab sich eine gute Vorhersagbarkeit der individuellen Fruchtbarkeit (b = 0,66; p < 0,0001). Somit folgt aus der vorliegenden Studie, dass die durchflusszytometrische Untersuchung von kryokonserviertem Bullensperma eine bessere Aussage bezüglich der Fertilität zulässt als die herkömmlichen Verfahren. 

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Baarz, Dagmar: Untersuchungen über die Eignung durchflusszytometrischer Testverfahren zur Beurteilung der Fertilität kryokonservierten Bullenspermas. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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