Untersuchungen über die Eignung durchflusszytometrischer Testverfahren zur Beurteilung der Fertilität kryokonservierten Bullenspermas

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene durchflusszytometrische Testverfahren an tiefgefrorenem Bullensperma dahingehend zu überprüfen, ob sie eine präzise Aussage bezüglich der zu erwartenden Befruchtungsleistung des Bullen zulassen. Zu diesem Zweck wurden die Spermaqualitätsparameter Plasmamembranintegrität, akrosomaler Status, Mitochondrienmembranpotential, Integrität der Spermachromatinstruktur, intrazellulärer Calciumgehalt, reaktive Sauerstoffspezies und Lipidperoxidation an 3 bis 7 Ejakulaten von insgesamt 34 Bullen der Rassen Holstein Friesian und Red Holstein durchflusszytometrisch mittels verschiedener Fluorochrome bestimmt. Neben der direkt nach dem Auftauen der Samenprobe durchgeführten Untersuchung wurde das Sperma für 3, zum Teil auch für 6 Stunden bei 37°C inkubiert und die Resultate untereinander verglichen. Zur Überprüfung möglicher Korrelationen zwischen den Testergebnissen und der Fertilität standen für alle Bullen die auf der Basis von insgesamt 28.219 künstlichen Besamungen berechneten Non-Return-Raten am Tag 56 (NRR56) zur Verfügung, die zwischen 51,0 % und 70,2 % bei einem Mittelwert von 62,4 ± 5,1 % differierten.   Die durchflusszytometrisch erhobenen Qualitätsparameter waren gut reproduzierbar. Zwischen den Ergebnissen zweier unabhängig voneinander durchgeführter Messungen von 2 verschiedenen Pailletten eines Ejakulats an zwei aufeinander folgenden Tagen bestanden hochgradige Korrelationen (r ³ 0,87; p < 0,05 bzw. 0,0001). Die ermittelten Intra-Class-Korrelationskoeffizienten lagen zwischen 0,75 und 0,98. Zwischen den durchflusszytometrischen Tests bestanden unmittelbar nach dem Auftauen keine oder lediglich gering- bis mittelgradige Korrelationen (0,33 £ r £ 0,52 bzw. -0,68 £ r £ -0,31; p < 0,05), die sich nach drei- bzw. sechsstündiger Inkubation nicht wesentlich veränderten (0,32 £ r £ 0,41 bzw. -0,59 £ r £ -0,37; p < 0,05). Die relative Variabilität der einzelnen Testergebnisse war mit 11,54 % bis 50,39 % relativ hoch. Im Falle plasmamembranintakter Spermien und Spermien mit positivem akrosomalem Status überwog der ejakulatbedingte, bei allen anderen Assays der individuelle Einfluss auf die Ergebnisvariation.   Innerhalb der Assays waren mittel- bis hochgradigen Zusammenhänge (0,63 £ r £ 0,98; p < 0,001) zwischen den Testergebnissen zu verzeichnen, die nach unterschiedlich langer Inkubation ermittelt worden waren. Die Verwendung von Stimulantien beeinflusste diese Korrelationen: weder plasmamembranintakte Spermien direkt nach dem Auftauen   (r = 0,30; p > 0,05) noch Spermien mit positivem akrosomalem Status 0 und 3 Stunden nach dem Auftauen (r = 0,25 bzw. r = 0,32; p > 0,05) korrelierten mit dem entsprechenden, mit Calcium-Ionophor A23187 stimulierten 3h-Wert. Außerdem stand die unmittelbar nach dem Auftauen ermittelte DHR-Fluoreszenzintensität mit Zusatz von H2O2 in keinem Zusammenhang zum unstimulierten Wert (r = 0,11; p > 0,05).   Geringgradige Zusammenhänge bestanden zwischen NNR56 und Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (r = 0,40; p < 0,05) bzw. plasmamembranintakten Spermien mit hohem intrazellulärem Calciumgehalt (r = -0,39; p < 0,05), jeweils direkt nach dem Auftauen. Nach dreistündiger Inkubation korrelierten sowohl der ermittelte Anteil von Spermien mit positivem akrosomalem Status (r = 0,44; p < 0,01) als auch von DFI-Spermien (r = -0,31; p < 0,08) geringgradig mit der NRR56. Aus einer multivariaten Analyse aller in Korrelation zur NRR56 stehender Parameter ergab sich eine gute Vorhersagbarkeit der individuellen Fruchtbarkeit (b = 0,66; p < 0,0001). Somit folgt aus der vorliegenden Studie, dass die durchflusszytometrische Untersuchung von kryokonserviertem Bullensperma eine bessere Aussage bezüglich der Fertilität zulässt als die herkömmlichen Verfahren.