Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur Beeinflussung der Funktion dendritischer Zellen durch Schwermetalle

Hünermann, Karoline

We here investigated the influence of heavy metals on dendritic cell (DC) function. Lead and manganese has been used for in vitro studies, whereas lead acetate has been brought in for a contact allergy model using Balb/c mice. For in vitro studies DC were obtained from murine bone marrow and cultured afterwards. As heavy metals are required not to influence viability or proliferation of DC and T cells these parameters were investigated first. None of the used concentrations (1, 10 and 100 µmol/l) of lead or manganese affected viability of DC or T cells; there was a slight inhibition of T cell-proliferation using the highest lead or manganese concentration (100 µmol/l). Next the amount of the proinflammatory cytokine TNF-α was measured in culture supernatant; there was no reduction neither through lead nor manganese. In a migration assay the increased migration after heavy metal incubation could be shown. There was a significant increase using 100 µmol/l lead or manganese respectively. The migration of DC depends on the induction of their maturation which again is related to an activation of intracellular MAPK (ERK, JNK, p38). As shown in own studies activation of p38 is necessary for the expression of several surface molecules (CCR7, CD80, CD86); after lead exposure p38 was activated in DC (100 µmol/l). In FACS analyses an increased CCR7-expression, which stimulated DC need in vivo to migrate to the draining lymph node, could be shown after treatment with lead (100 µmol/l) and manganese (10 µmol/l) respectively. After DC have been stimulated they migrate to the lymph node to interact with naïve T cells via CD80 and CD86 in order to induce T cell-mediated immunity. We observed an increased CD80-expression after lead exposure (1 and 10 µmol/l) as a sign of DC-maturation. Despite of that there was no effect of lead in any used concentrations on CD86-expression. The Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR) represents the proliferation rate of stimulated T cells. For lead and manganese we saw a significant increase of T cell proliferation in every concentration used. Next culture supernatant from the MLR was used for determination of the CCL2-content. We discovered an inhibited amount of CCL2 as either a sign of DC and T cell interaction or induction of Th2 response. The current findings suggest that lead and manganese have modulatory influences on the immune system. The chosen concentrations stimulate DC leading to maturation as well as changed phenotype and T cell stimulation. These results could be confirmed by in vivo studies. Therefore the effect of lead acetate in two different concentrations was analysed in a contact allergy model using TDI and DNCB as contact allergens. The mouse ear swelling as well as weight of lymph nodes and the number and the kind of cells from the lymph node was used as functional parameter. Another priority was the migration and the cytokine production by DC. Lead acetate has an activating influence on Th2 response which is initially induced by TDI: mouse ear swelling can significantly be increased by lead (1.265 g/l) in the phase of challenge. Both concentrations lead to an increased number of lymph node cells just as the number of CD11c/CD40 positive DC who rose after lead acetate exposure. There has also been a slight increase of DC migration in the migration assay and of IL4-production measured in homogenized mouse ear tissue. Cytokines as IL-4, IL-1β or IFN-γ detected in culture supernatants from lymph node cells have not been influenced by lead acetate at all. In the contact allergy model where DNCB induces a Th1 response lead acetate has no remarkable effect.

In der vorliegenden Arbeit ist die Beeinflussung dendritischer Zellfunktionen   durch Schwermetalle untersucht worden. Es sind bei In-vitro-Studien die Schwermetalle Blei und Mangan, und in einem Kontaktallergiemodell mit Balb/c-Mäusen Bleiacetat zum Einsatz gekommen. Die In-vitro-Untersuchungen erfolgten an DC, die aus dem murinen Knochenmark gewonnen und kultiviert wurden. Als Voraussetzung für die sich anschließenden Versuche sind die Vitalität der DC und der T-Zellen, sowie die Proliferation der T-Zellen untersucht worden. Die verwendeten Konzentrationen von Blei und Mangan (1, 10 und 100 µmol/l) zeigten keinerlei Beeinträchtigungen der Vitalität; die Proliferation wurde nur in der höchsten Konzentration durch Blei bzw. Mangan inhibiert. Im Anschluss erfolgte die Messung des proinflammatorischen Zytokins TNF-α aus Kulturüberständen, wobei keine Induktion weder durch Blei, noch Mangan festzustellen war. In einem Migrationsassay konnte die durch Blei und Mangan gesteigerte Auswanderungsbereitschaft der DC gezeigt werden. In der Konzentration 100 µmol/l bei Blei bzw. Mangan nimmt die Migration signifikant zu. Voraussetzung für diese  Migration ist die Induktion der DC-Maturation einhergehend mit einer Aktivierung intrazellulärer MAPKinasen (ERK, JNK, p38). Die in eigenen Untersuchungen dargestellte Aktivierung von p38, insbesondere durch Blei in der Konzentration 100 µmol/l, ist unerlässlich für die Expression diverser Oberflächenmoleküle (CCR7, CD80, CD86 etc.). Eine erhöhte Expression des Rezeptors CCR7, der in vivo von stimulierten DC für die Wanderung in den drainierenden Lymphknoten benötigt wird, konnte in der FACS-Analyse durch Inkubation mit Blei (100 µmol/l) und Mangan (10 µmol/l) gezeigt werden. Nachdem die DC aktiviert sind, wandern sie zu naiven T-Zellen und nehmen u.a. über die costimulatorischen Oberflächenmoleküle CD80 und CD86 Kontakt zu diesen auf. Die Folge ist eine T-Zell-Stimulation und für die Induktion einer Immunantwort die Proliferation der T-Zellen. Es konnte die Expression von CD80 durch Blei (1 und 10 µmol/l) als Zeichen der DC-Maturation festgestellt werden. Auf die CD86-Expression hat Blei in den hier verwendeten Konzentrationen keinen Effekt. Die Mixed Leukocyte Reaction (MLR) spiegelt die Proliferationsrate stimulierter T-Zellen wider. Blei und Mangan führen in allen drei Konzentrationen zu einem signifikanten Anstieg der       T-Zellproliferation. Der aus Kulturüberständen der MLR bestimmte CCL2-Gehalt wird durch die Inkubation mit Blei signifikant inhibiert, was ein Zeichen für eine Bindung zwischen T-Zellen und DC, oder aber eine Induktion einer Th2-Antwort sein kann. Abschließend kann in Anbetracht der Ergebnisse von einem immunmodulatorischen Effekt durch Blei bzw. Mangan gesprochen werden. Die gewählten Schwermetall-konzentrationen wirken stimulierend auf die DC und führen zu deren Maturation einhergehend mit Veränderungen des Phänotyps und Stimulation der T-Zellen. Dieses kann im Bezug auf Blei durch die In-vivo-Studie bestätigt werden. Hierbei ist in einem Kontaktallergiemodell mit TDI bzw. DNCB der Einfluss von Blei in zwei unterschiedlichen Konzentrationen untersucht worden. Als funktionelle Parameter dienten zum einen die Ohrschwellung, das Lymphknotengewicht sowie die Anzahl und Art der Zellen des regionalen Lymphknotens. Zum anderen ist die Migration aus der Ohrhaut und die Zytokinproduktion von DC untersucht worden. Blei zeigt einen stimulierenden Effekt auf die durch TDI induzierte Th2-Antwort: Es kommt in der Challengephase zu einer signifikanten Steigerung der Ohrschwellung durch Blei (1,265 g/l), sowie zu einem signifikanten Anstieg der Lymphknotenzellzahl durch beide Bleikonzentrationen. Auch die Anzahl CD11c/CD40-positiver DC im Lymphknoten wird durch Blei (0,126 g/l) erhöht. Im Skin-Migration-Assay und bei der IL4-Produktion gemessen im Ohrhomogenat  kommt es zu einem leichten Anstieg durch Blei. Die Zytokine IL-4, IL-1β und IFN-γ aus Überständen der Zellkulturen von Lymphknotenzellen zeigen keinerlei Effekte des Schwermetalls. Im DNCB-Modell wird die durch das Allergen induzierte Th1-Antwort nicht durch Blei beeinflusst. 

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Hünermann, Karoline: Untersuchung zur Beeinflussung der Funktion dendritischer Zellen durch Schwermetalle. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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