Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur Beurteilung substituierter Lipasen im Modell pankreasgangligiertes Miniaturschwein

Zantz, Sonka Tieneke

The substitution of digestive enzymes is an essential treatment of pancreatic exocrine insufficiency (PEI). The aim of the present investigation was to develop an In-vivo lipase screening test, which requires only small amounts of enzymes to estimate enzyme efficacy. The test which was developed was based on BECKER’s (2005) successfully established protease and amylase screening tests. At first it was necessary to select a suitable test diet. The assay was then established using different doses of a well known and highly potent standard multienzyme product (PK). In a third step the efficacy of 5 microbial lipases were compared to each other and to that of the standard product. The studies were performed in 10 female Göttingen Minipigs all fitted with an ileo-caecal-reentrant fistula. Additional pancreatic exocrine insufficiency was induced by ligation of the pancreatic duct (PL-animals) in 7 of them. The remaining 3 pigs served as controls (KT-animals). The test diet and the chyme samples were analysed for crude nutrients according to standard VDLUFA methods (NAUMANN u. BASSLER 2004). Chromic oxide Cr2O3 was analysed after PETRY u. RAPP (1970). For the analysis of crude fat Ankom Technology Corporation® was used, a method which was validated in this study. The test diet was based on a liquid nutritional supplement called “Calshake®”, which was optimised for single lipase dose application mainly with respect to crude fat content and homogeneity. The final test diet contained (g / kg) 351 crude fat (cfa); 76,9 crude protein (cp); 46,3 crude fibre (cfi); 22,8 crude ash (ca); 2,5 Cr2O3. This liquid test meal (ca. 150 g DM), into which the test enzymes were mixed, was given only once, on the morning of each trial day, while in the evenings of the trials and on all other days the pigs were fed a regular diet (g / kg DM: 49,8 cfa / 189 cp / 477 st / 30,3 cfi / 53 ca) without enzymes. An exception was the evening meal given 12 hours before starting each trial: instead of the regular diet a fat-free liquid meal was offered (ProvideXtra®g /100 ml: 525 KJ / 3,75 cp / 27,5 carbohydrates / 5,5 sugar / 0 cfa / 1 cfi / 80 ml H2O). The chyme collection was started individually for each pig with the arrival of the Cr2O3 (green) labelled chyme of the test diet at the ileal fistula and was finished after an 8-hour-chyme collection. The dose-dependency of a standard multienzyme product (PK) on fat digestibility was investigated and three doses (500, 5000, 75000 IU) selected. Five unknown microbial lipases (E1 – E5) were then assayed in this newly developed lipase screening test using the same three doses (500, 5000 and 75000 IU). Therefore the same trial design used by BECKER (2005) (feeding, collection and time schedule for testing) was used in this screening test. After single dose application of the test diet the efficacy of the lipases was estimated according to the following parameters: absolute DM- and cfa- appearance and disappearance rate and the relationships between them. The results of the screening test with two of the microbial and the standard lipase supplement were compared to results in previously performed standard total digestibility trials. By calculating parallel flow rates it could be excluded that there was separation of the diet’s components (DM, cfa and marker). The “green” chyme of the test diet flowed regularly 4 to 6 hour postprandial at the ileal fistula. Although the cfa digestibility was improved by using a liquid test diet, marked differences were observed between PL- and KT-animals (Rfe-VR: PL-0-Tiere 10,8 %; KT 86,4 %), due to the high fat content of the diet (34,6 %). The conspicuous green colour of the marker, Cr2O3, was used as a signal to determine the time of arrival of the test meal at the ileal fistula and to separate this from earlier meals (brown chyme). Thus the marker indicated the ileal arrival of the test diet and the beginning of the 8 hour chyme collection. The standard multienzyme product PK caused a dose-dependent improvement in cfa digestibility. Subsequently, the screening test was used to compare the in-vivo- efficacy of five microbial lipases. For all five enzymes dose-dependent responses were measured. Several lipases approached the level of efficacy of PK at the highest dosage used, although differences were observed at the low and medium dosages. Nevertheless in all trials PK and E1 tended to show higher potency than the other enzymes (Rfe-VR: PK 83,5 %; E1 77,0 %; E3 68,6 %; E5 65,0 %; E2 61,5 %; E4 60,1 %;). The five test lipases and PK showed a corresponding ranking of most parameters. The following tendentious ranking demonstrates the precaecal cfa disappearance rate (highest dosage): PK, E1, E3, E5, E2, E4 The ranking of selected lipases in the screening test compared well to results observed in standard efficacy studies by KARTHOFF (2004) and BECKER (2006, personal communication). Thus for PK and the test lipases E3 and E4 the same ranking was ascertained in total digestibility studies. Furthermore, an in-vitro- digestibility model yielded a similar ranking of lipases (exception: E5). Because of different trial conditions E5’s in-vivo-results were not directly comparable. Conclusion: A screening test has been established that allows differentiation and selection of lipases according to their efficacy in-vivo. The results of the screening test compare well to findings in standard in-vivo-digestibility trials and additional in-vitro- assays. This lipase screening test is not a replacement for standard digestibility trials, but is to be used as a way to estimate the in-vivo-efficacy of substituted enzymes with a minimum of time and enzyme consumption. This allows preliminary selection of effective enzymes, whose efficacy has still to be properly quantified in standard digestibility trials.

Die Substitution von Verdauungsenzymen stellt die entscheidende Möglichkeit für die Behandlung einer exokrinen Pankreasinsuffizienz (EPI) dar. Vor diesem Hintergrund verständlich zielten die eigenen Untersuchungen auf die Entwicklung eines In-vivo-Schnelltests zur Wirksamkeitsprüfung neuer Enzyme bei Verfügbarkeit nur geringer Enzymmengen. Basierend auf dem von BECKER (2005) erfolgreich etablierten Screening-Test für Amylasen und Proteasen sollte in der vorliegenden Arbeit ein Schnelltest für Lipasen entwickelt werden. Hierbei ging es zunächst um die Entwicklung einer geeigneten Testmahlzeit, darauf folgten vergleichende Untersuchungen zur Wirksamkeit neuer Lipasen, in denen ein bekannt wirksames Multienzymprodukt als Positivkontrolle zum Einsatz kam. Ziel des Schnelltests war eine vergleichende Bewertung verschiedener Lipasen, um Weiterentwicklung und Produktion größerer Enzymmengen nur auf die erfolgreichsten Neuentwicklungen beschränken zu können. Für die In-vivo-Untersuchungen standen insgesamt 10 adulte weibliche Göttinger Miniaturschweine mit ileocaecaler Umleitungsfistel zur Verfügung. Zur Auslösung einer EPI war bei 7 Tieren der Ausführungsgang des Pankreas ligiert worden (PL-Tiere), wohingegen die übrigen 3 Tiere als Kontrolltiere (KT) dienten. Die Analyse des Rohnährstoffgehaltes der Futtermittel erfolgte nach den Vorschriften zur Weender-Analyse von NAUMANN u. BASSLER (2004). Die Chromoxidbestimmung wurde nach PETRY u. RAPP (1970) durchgeführt. Die Analyse des Fettgehaltes der Futter- und Chymusproben fand unter Verwendung der Geräte der Firma Ankom Technology Corporation® (AnkomHCl Hydrolysis System und AnkomXT15 Extraktor) statt, wobei zuvor eine Validierung der Methoden durchgeführt wurde. Basis der Testmahlzeit war ein flüssiges Nahrungsergänzungsmittel, das im Rahmen der Optimierung einer einmalig zu applizierenden markerhaltigen Testmahlzeit modifiziert wurde. Die Versuchsmahlzeit wurde insbesondere hinsichtlich des Fettgehaltes verändert, so dass sie schließlich aus (g / kg Trockensubstanz (TS)): 351 Rohfett (Rfe); 76,9 Rohprotein (Rp); 46,3 Rohfaser (Rfa); 22,8 Rohasche (Ra); 2,5 Cr2O3 bestand. Diese flüssige Testmahlzeit (ca. 150 g TS) wurde lediglich am Morgen des Versuchstages verabreicht, während sonst das übliche Mischfutter (g / kg TS: 49,8 Rfe / 189 Rp / 477 Stärke / 30,3 Rfa / 53 Ra) ohne Enzymzulage zum Einsatz kam. Am Vorabend des Versuchstages wurden anstelle des o. g. Mischfutters 400 ml einer fettfreien Trinkmahlzeit (g /100 ml: 525 KJ / 3,75 Rp / 27,5 KH / 5,5 Zucker / 0 Rfe / 1 Rfa / 80 ml H2O) angeboten. Die Chymuskollektion begann mit der Anflutung der durch den Marker farblich gekennzeichneten Testmahlzeit an der ilealen Fistel und endete 8 Stunden später. In diesem neu entwickelten Lipase-Screening wurden fünf verschiedene Monolipasen mikrobiellen Ursprungs (E1 - E5) in drei verschiedenen Dosierungen (500, 5 000 und      75 000 IE) geprüft. Hierzu wurde das von BECKER (2005) entwickelte Versuchsdesign (Fütterungs-, Kollektions- und Versuchsintervalle) angewandt. Die Beurteilung der Wirksamkeit der zugelegten Lipasen nach einmaliger Verabreichung der Testmahlzeit erfolgte anhand nachstehender Parameter: absolute TS- und Rfe-Anflutung, Rfe-Konzentration im Chymus, Rfe / Cr2O3-Verhältnis und kalkulierte Verschwindensraten (VR) für TS und Rfe. Eine Korrelation zwischen Ergebnissen im Schnelltest und denen klassischer Verdaulichkeitsstudien wurde anhand von Daten bereits vorgenommener Untersuchungen geprüft. Die optimierte Testmahlzeit führte zu einer homogenen Chymusanflutung am terminalen Ileum. Anhand paralleler relativer Flussraten von Trockensubstanz, Rohfett und Marker konnte eine Entmischung der Komponenten weitestgehend ausgeschlossen werden. Der „grüne“ Chymus der Testmahlzeit flutete regelmäßig  4 - 6 Stunden ppr. am Ileumende an, so dass von einer zügigen Magen-Dünndarmpassage auszugehen war. Infolge des hohen Fettgehaltes (34,6 % der Testmahlzeit) war es trotz der flüssigen Darreichungsform möglich, PL-0-Tiere von gesunden Kontrolltieren zu unterscheiden (Rfe-VR: PL-0-Tiere 10,8 %; KT 86,4 %). Der Lipase-Screening-Test wurde eingesetzt, um fünf Monolipasen vergleichend einer ersten In-vivo-Wirksamkeitsprüfung zu unterziehen. Dabei konnten für alle Enzyme bezüglich der Rfe-VR (und weiterer erhobener Parameter) dosisabhängige Effekte ermittelt werden. In der höchsten Dosierung erreichten mehrere Enzyme das Niveau des bekannt hochwirksamen Multienzymproduktes PK, wobei die Rangierung PK, E1, E3, E5, E2, E4 entstand. In den verschiedenen Dosierungen waren produktabhängige Unterschiede zu erkennen, wobei in allen Untersuchungen PK und E1 tendenziell den anderen Testenzymen überlegen waren (Rfe-VR (%): PK 83,5; E1 77,0; E3 68,6; E5 65,0; E2 61,5; E4 60,1). Für die meisten Parameter (s. o.) konnte eine übereinstimmende Rangierung der fünf Testlipasen und des Multienzymproduktes PK erstellt werden. Um die im Lipase-Screening-Test ermittelte Rangierung abzusichern, wurde auf Ergebnisse aus früheren Studien zur Gesamtverdaulichkeit zurückgegriffen, in denen zwei (E3 und E4) der fünf Testlipasen eingesetzt wurden. Zusätzlich wurden Ergebnisse aus In-vitro-Verfahren mit denen des Screening-Tests verglichen. Die verschiedenen Verfahren ergaben dabei eine übereinstimmende Rangierung; stets war das Testenzym E3 in seiner Wirksamkeit dem Produkt E4 überlegen. Schlussfolgerung: Der im Rahmen dieser Studie neu entwickelte In-vivo-Screening-Test zur vergleichenden Beurteilung von Lipasen erlaubte eine Differenzierung der Enzyme anhand ihrer Wirksamkeit. Diese ergänzende Methode stellt dabei keinen vollständigen Ersatz für herkömmliche Verdaulichkeitsstudien dar, sondern ein Verfahren, mit Hilfe dessen innerhalb kürzester Zeit (nach einmaliger Fütterung der Testmahlzeit mit Enzymzulage) und unter minimalem Enzymverbrauch eine erste Einschätzung der Wirksamkeit neu entwickelter Lipasen möglich ist. Die in dem Screening-Test ermittelte erste In-vivo-Bewertung erlaubt damit eine gezielte Vorauswahl effektiver Enzyme, deren weitere Entwicklung und Produktion forciert werden kann.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Zantz, Sonka Tieneke: Untersuchungen zur Entwicklung eines Screening-Tests zur Beurteilung substituierter Lipasen im Modell pankreasgangligiertes Miniaturschwein. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export