Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Testikuläre Gewebetextur und Durchblutung sowie Ejakulatbeschaffenheit von Bullen unter Einbeziehung der Analyse reaktiver Sauerstoffspezies und des Spermienchromatins nach experimenteller skrotaler Hyperthermie

Albrecht, Pia Nicola

The aim of this study was to investigate the suitability of two dimensional parameters produced on B-mode ultrasound images during examining alterations of the echotextur in testes of bulls generated by inflammatory processes using the model of experimentally induced hyperthermia. In addition, it was investigated to which extent the alterations of blood flow of the testicular artery induced by inflammation in the testicles could be detected by doppler ultrasonography. It was also to clarify whether the detection of reactive oxygen species by staining the sperms with dihydrorhodamin provide an objective possibility for the assessment of sperm quality. The hyperthermia was generated by local heating of testes of four bulls (designated as bulls A-D) 48 hours long. The surface temperature of the scrotum rose between 3.9 and 6.6°C depending on the animals during the phase of heating. The investigation of the bulls started one week before the heating and was continued in the ten following weeks. The examination of echotexture and blood flow was carried out once per week, the conventional and flow cytometric data were measured twice per week always keeping the same interval between each investigations. Mean grey scale value, contrast and vertical fraction were defined by computer assisted grey scale analysis on B-mode ultrasound images whereas the mean blood flow and resistance index were measured by colordoppler sonography. The mean grey scale value as a parameter of the first order as well as contrast and vertical fraction representing parameters of the second order were generated by the grey scale analysis software MaZda® during the echotexture analysis. As flow cytometric assays the SCSA™ as well as the Dihydrorhodamin staining were carried out to investigate the chromatin structure and the production of reactive oxygen species of the sperms. During the clinical investigation irritation of the scrotal skin with clear swelling of the testes was observed at bull B after hyperthermia without influencing the general condition of the animal. Only minor alterations were noticed at the scrotum of the other three bulls. All of the parameters measured on the B-mode ultrasound images of the testicle tissues from every bull showed the highest values in first or second week subsequent to the hyperthermia. The data of mean grey scale value and contrast of three bulls reached again the base level in the third week and at bull B in the sixth week. The values of vertical fraction dropped to the base level in the second week at two bulls, however at the bulls B and D it decreased further and started to rise in the fifth week till reaching the base level again. The mean blood flow of three bulls was decreased only in the first week and returned to the initial level at the second week. The mean blood flow of bull B increased over the base level and stayed slightly elevated till the end of the experiment. Only the resistance index of the last mentioned bull showed a rise in the first week that was followed by a fall reaching the base level in week five. The forward motility fell after finishing the heating showing the lowest levels in the fifth week and reached nearly the initial level later on. Secondary sperm aberrations were observed between the first and forth week at bull B furthermore between the first and sixth week at bulls A, C and D. Both the sperm concentration and the total sperm number were reduced from the third week showing a clear rise >from the ninth week. Primary sperm aberrations were noticed till the end of the examinations including week ten. An obvious increase of inflammatory, epithelial and spermatogenetic cells was observed between the third and sixth week at bulls A, C, and D in addition between the third and the eight week at bull B. All of the bulls showed the highest values in the fifth week. Increased proportion of sperms with damaged chromatin was observed after SCSA™ staining during the flow cytometric examination that was comparable to the rise of the primary sperm aberrations. The fluorescence intensity after Dihydrorhodamin staining rose in the first week that was followed by a decline reaching the lowest values in week four and five and returning to the base level subsequently. The accomplished examinations show that analysis of the parameters of the second order on B-mode ultrasound images as well as the mean blood flow detected by doppler sonography provide additional information about the alterations of the testes compared to the conventional methods. In addition, the analysis of the amount of reactive oxygen species was found to be a good indicator of restricted sperm functions at an early stage.

Ziel dieser Arbeit war es, am Modell einer experimentell induzierten Hyperthermie die Aussagekraft der zweidimensionalen Graustufenanalyse ultrasonographisch erstellter B-Bilder im Hinblick auf entzündungsbedingte Echotexturveränderungen des Bullenhodens zu untersuchen. Des Weiteren sollte überprüft werden, inwieweit Blutflussveränderungen der A. testicularis auf der Grundlage entzündlicher Prozesse mit Hilfe der Dopplersonographie erfasst werden können. Bei der durchflusszytometrischen Analyse stellte sich die Frage, ob der Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies mit Hilfe der Dihydrorhodaminfärbung eine geeignete Methode zur Beurteilung der Spermaqualität darstellt. Die Hyperthermie wurde mittels einer lokalen Wärmeisolierung des Skrotums von vier Bullen (bezeichnet als Bullen A-D) über 48 Stunden herbeigeführt. Während der Erwärmung konnten individuell unterschiedliche Erhöhungen der skrotalen Oberflächentemperatur zwischen 3,9 und 6,6°C verzeichnet werden. Vor Anlegen des Gurtsystems fand eine Erhebung der physiologischen Daten sowie in den 10 folgenden Wochen die Aufzeichnung der hyperthermiebedingten Veränderungen statt. Die Echotextur- sowie Blutflussanalyse fand einmal wöchentlich, die Erhebung der konventionellen und durchflusszytometrisch ermittelten Parameter zweimal pro Woche in immer gleich bleibendem Abstand statt. Bei der Echotexturanalyse von B-Bildern wurden die Parameter mittlerer Grauwert, Kontrast und Vertical Fraction bestimmt. Eine farbdopplersonographische Untersuchung wurde zur Ermittlung der mittleren Blutflussgeschwindigkeit und des Resistance Index angewendet. Die Graustufenanalysesoftware MaZda® diente der Erhebung des mittleren Grauwerts als ein Parameter erster Ordnung, sowie des vertikalen Fraktionswerts und des Kontrasts als Analyseparameter zweiter Ordnung. Durchflusszytometrisch wurde der SCSA™ zur Bestimmung der Chromatinstruktur und die Messung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies nach Dihydrorhodaminfärbung durchgeführt. Bei der klinischen Untersuchung der Tiere wies nur der Bulle B nach der Hyperthermie eine Reizung der Skrotalhaut am Hodenhals mit deutlicher Schwellung des Skrotums bei ungestörtem Allgemeinbefinden auf. Die anderen drei Tiere zeigten nur geringe skrotale Umfangsvermehrungen. Die Echotexturanalyse der sonographischen B-Bilder des Hodengewebes ergab bei den vier Bullen für alle Parameter direkt im Anschluss an die Hyperthermie in den Wochen 1 bzw. 2 die höchsten Werte. Eine Rückkehr der Parameter mittlerer Grauwert und Kontrast auf das Ausgangsniveau konnte bei drei Tieren in Woche 3, bei Tier B allerdings erst in Woche 6 verzeichnet werden. Der vertikale Fraktionswert nahm bei 2 Tieren in Woche 2 wieder die ursprünglichen Werte an, während er bei den Bullen B und D über das Ausgangsniveau hinaus abfiel und erst ab Woche 5 kontinuierlich wieder bis auf die Ursprungswerte anstieg. Die mittlere Blutflussgeschwindigkeit war nur in Woche 1 abgefallen und lag ab Woche 2 bei drei Tieren wieder auf Normalniveau. TAMV des Bullen B stieg über den Ursprungswert hinaus an und blieb bis Versuchende auf einem leicht erhöhten Niveau. Der Resistance Index wies nur beim letztgenannten Tier eine Erhöhung in Woche 1 mit anschließender Rückkehr bis auf Ausgangsniveau (Woche 5) auf. Bei der konventionellen Spermaanalyse zeigte sich eine Verringerung der Vorwärtsmotilität direkt nach Abnahme des Gurtsystems mit Tiefpunkt in Woche 5 und anschließender Rückkehr bis kurz unter das Ausgangsniveau. Sekundäre Spermienanomalien konnten zwischen den Wochen 1 und 4 (Tier B) bzw. 1 und 6 (Tiere A, C und D) gemessen werden. Ab Woche drei wiesen die Ejakulate eine Verringerung von Konzentration und Gesamtspermienzahl mit deutlichem Wiederanstieg ab Woche 9 auf, und es konnten primäre Spermienanomalien bis einschließlich Woche 10 verzeichnet werden. Zwischen Woche 3 und Woche 6 (Bullen A, C und D) bzw. 8 (Bulle B) wiesen die Ejakulate deutliche Zunahmen von Entzündungs-, Epithel- und Spermatogenesezellen mit Höhepunkt in Woche 5 auf. Durchflusszytometrisch wurde eine mit dem Anstieg der primären Spermienanomalien vergleichbare Zunahme chromatingeschädigter Spermien nach SCSA™-Färbung protokolliert. Die Fluoreszenzintensität nach Dihydrorhodaminfärbung stieg in Woche 1 kurzzeitig an, fiel dann auf Tiefstwerte in Woche 4 bzw. 5 ab und normalisierte sich anschließend auf Ausgangsniveau. Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass bei der Auswertung sonographischer B-Bilder die Bestimmung von Echotexturparametern zweiter Ordnung sowie die farbdopplersonographische Erfassung der mittleren Blutflussgeschwindigkeit gegenüber herkömmlichen Verfahren zusätzliche Informationen über Hodenveränderungen liefern. Außerdem können mit Hilfe der durchflusszytometrischen Analyse der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies frühzeitig Einschränkungen in der Funktion der Spermien nachgewiesen werden.

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Albrecht, Pia Nicola: Testikuläre Gewebetextur und Durchblutung sowie Ejakulatbeschaffenheit von Bullen unter Einbeziehung der Analyse reaktiver Sauerstoffspezies und des Spermienchromatins nach experimenteller skrotaler Hyperthermie. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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