Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss von Interferon-[beta] auf Oligodendrozyten

Heine, Sandra

Spontaneous remyelination and repair mechanisms in multiple sclerosis are mostly insufficient and contribute to clinical disability. Treatments improving this process are not yet available. Interferon-beta (IFN-β) is known to have a disease modifying effect in reducing the number of relapses in relapsing –remitting multiple sclerosis (MS) for more than a decade. The effect of IFN-β is thought to be mediated by the modulation of immune cells and the influence on glial cells. The cellular and molecular mechanisms that underlie the beneficial effects of IFN-β are not yet elucidated. Therefore, the aim of this study was to investigate the influence of IFN-β on proliferation and differentiation of oligodendroglia, both as a direct effect and mediated indirectly via other glial cells. For the proliferation and differentiation assays in vitro, mixed and purified glial cell cultures were stimulated by different concentrations of IFN-β. Proliferation was assessed by incorporation of 5- bromo-2´deoxyuridine (BrdU) and the marker for OPC A2B5. There was no influence of IFN-β on proliferation rate of OPC. The differentiation of OPC into mature oligodendrocytes was measured by using double immunofluorescent staining for the OPC marker A2B5 and the oligodendrocyte marker GalC. The addition of IFN-β at a concentration of 100 IU/ml and 1000 IU/ml to mixed glial cultures led to a statistically significant (p<0,01) increase of A2B5+cells in relation to GalC+cells, demonstrating an inhibition of differentiation by IFN-β. To further substantiate this result another measurement of oligodendrocyte differentiation was used by counting the numbers of processes per oligodendrocyte as visualised by GalC staining. The number of processes per oligodendrocyte was decreased in IFN-β treated cultures as compared with control cultures as a sign of less differentiated cells. To investigate whether the inhibition of differentiation is a direct effect on OPC or if it is mediated indirectly via other glial cells, differentiation of isolated purified OPC was evaluated in the presence of IFN-β. There was no effect observed, suggesting that the inhibition of OPC differentiation by IFN-β is mediated indirectly. Are the observed effects of IFN-β on the differentiation of OPC also relevant in vivo? To answer this question IFN-β-knock out (k/o) mice and wild type (C57Bl/6 mice) control mice were subjected to the cuprizone model. The extent of de- and remyelination was evaluated by scoring of LFB staining and myelin protein immunohistochemistry at several time points (at week 3 and 6 during demyelination; week 7, 9, and 12 during remyelination). For selected time points electron microscopy studies were done for quantitative analysis. Astrocytic and microglial responses during de- and remyeliation were quantified by GFAP and MAC-3-positive cells in the corpus callosum. The number of OPC within the demyelinated lesion was assessed by quantitative analysis of NG2 immunohistochemistry. For the assessment of axonal pathology immunohistochemistry for the non-phosphorylated neurofilament (SMI-32) was used. In IFN-β-k/o mice demyelination was significantly reduced in the 3rd week (p = 0.019 LFB) and in the 6th week (p = 0,03 MOG). During the remyelination phase IFN-β-k/o mice showed a more rapid remyelination as compared to the controls (p = 0,03 LFB, p = 0,003 PLP, p = 0,001 MOG at week 7). The overall amount of remyelination after 12 weeks did not differ between the two groups. Decreased demyelination in IFN-β-k/o mice was paralleled by a diminished astrocytic and microglia response (p= 0,025 for microglia at week 3, p=0,019 for astrocytes at week 6), whereas the more rapid remyelination was paralleled by an increased number of oligodendrocyte precursor cells within the demyelinated lesion (p = 0,046 at week 6). Evaluation of axonal pathology showed no differences between IFN-β-k/o mice and controls. Our results point to a modulatory effect of IFN-β on de- and remyelination. In particular, we observed a dose dependent inhibition of OPC differentiation by IFN-β in vitro. In the cuprizone model, IFN-β-k.o. mice exhibited a more rapid remyelination which was paralleled by an increased number of OPC within the demyelinated lesion. It is conceivable that similar mechanisms mediate IFN-β effects in vivo and in vitro, therefore we postulate that a lack of the IFN-β-mediated inhibitory effect on OPC differentiation led to a more rapid remyelination in IFN-β-k.o. mice. Further studies are necessary to elucidate the molecular mechanisms of IFN-β and glial cells in multiple sclerosis remyelination.

Spontane Remyelinisierung und Reparationsmechanismen in Läsionen der Multiplen Sklerose treten nur unvollständig auf und führen zu klinischen Behinderungen der Patienten. Therapien zur Verbesserung dieser Remyelinisierungsvorgänge liegen bisher nicht vor. Interferon-β (IFN-β) wird seit über einer Dekade aufgrund seiner immunmodulierenden Wirkung vor allem bei der schubförmig verlaufenden Form der MS therapeutisch eingesetzt. Über die Wirkungsweise von IFN-β wird angenommen, dass diese indirekt durch Immunzellen und durch Gliazellen vermittelt wird. Welche zellulären und molekularen Mechanismen den positiven Auswirkungen von IFN-β zu Grunde liegen ist bisher noch nicht vollständig geklärt. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Wirkung von IFN-β sowohl direkt als auch indirekt, durch andere Gliazellen vermittelt, auf die Proliferation und Differenzierung der OPCs zu untersuchen. In den Proliferations- und Differenzierungsuntersuchungen in vitro wurden gemischte Gliazellkulturen und gereinigte Oligodendrozyten Vorläuferzellkulturen mit verschiedenen Konzentrationen von IFN-β stimuliert. Die Proliferation wurde anhand von 5-Bromo-2`Deoxyuridine (BrdU) Inkorporation und dem OPC-Marker A2B5 ermittelt. IFN-β zeigte hierbei keinen Effekt auf die Proliferationsrate von OPCs. Zur Bestimmung der Differenzierung der OPCs zu reifen Oligodendrozyten wurde die Doppel-Immunofluoreszenzfärbung mit den Markern A2B5 für OPCs und GalC für reife Oligodendrozyten verwendet. In den Konzentrationen 100 IU/ml und 1000 IU/ml führte IFN-β in den gemischten Gliazellkulturen zu einer Hemmung der Differenzierung, die sich in einem statistisch signifikanten (p<0,01) Anstieg von A2B5+Zellen im Vergleich mit GalC+Zellen darstellte. Zusätzlich konnte in den mit IFN-β behandelten Kulturen verglichen mit den Kontrollkulturen eine Verminderung der Anzahl der Zellfortsätze, als weiteres Zeichen der gehemmten Differenzierung, festgestellt werden. Um herauszufinden, ob diese Hemmung der Differenzierung ein direkter Effekt des IFN-β auf die OPCs ist oder indirekt durch andere Gliazellen vermittelt wird, wurde der Einfluss von IFN-β auf isolierte gereinigte OPCs untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass IFN-β keinen Effekt bewirkte und die Hemmung der Differenzierung der OPCs somit indirekt durch andere Gliazellen ausgelöst wird. Es stellte sich die Frage, ob die beobachteten Effekte auch in vivo relevant sind. Um diese Frage zu beantworten, wurden IFN-β-defiziente Mäuse (IFN-β-k.o.) und Wildtyp-Mäuse (C57/Bl6) als Kontrollen in dem Cuprizonemodell verglichen. Der Grad der De- und Remyelinisierung wurde anhand der Bewertungen (Scoring) von LFB und immunhistochemischen Myelinproteinfärbungen zu verschiedenen Zeitpunkten (3. Woche und 6. Woche für die Demyelinisierung; 7., 9. und 12 Woche für die Remyelinisierung) ermittelt. Zusätzlich wurden selektierte Zeitpunkte elektronenmikroskopisch analysiert. Astrozyten und Mikroglia wurden während der De- und Remyelinisierung mit den Markern GFAP und MAC-3 quantifiziert. Mit der immunhistochemischen Färbung für den Marker NG2 konnte die Anzahl der Oligodendrozytenvorläuferzellen identifiziert werden. Um das Ausmaß des axonalen Schadens festzustellen, wurde die immunhistochemische Färbung des nicht-phosphorylierten Neurofilaments (SMI-32) durchgeführt. In der 3. (p = 0,019 LFB) und in der 6. (p = 0,03 MOG) Versuchswoche zeigte sich, dass die IFN-β-k.o.-Mäuse signifikant weniger stark demyelinisierten als die Kontrollen. In der Remyelinisierungsphase fiel eine beschleunigte Remyelinisierung im Vergleich mit den Wildtyptieren auf (p = 0,03 LFB, p = 0,003 PLP, p = 0,001 MOG in der 7. Versuchswoche). In der 12. Versuchswoche zeigten beide Tiergruppen jedoch keinen Unterschied im Grad der Remyelinisierung. Während der verminderten Demyelinisierung der IFN-β-k.o.-Tiere kam es zu einem geringeren Auftreten von Astrozyten und Mikroglia (p= 0,025 für Mikroglia in der 3. Woche, p= 0,019 für Astrozyten in der 6. Woche). In der schnelleren Remyelinisierung war hingegen ein vermehrter Anstieg der Oligodendrozytenvorläuferzellen in den demyelinisierten Läsionen zu verzeichnen (p = 0,046 in der 6. Versuchswoche). Die Untersuchungen des axonalen Schadens zeigten keinen Unterschied zwischen den IFN-β-k.o.-Mäusen und den Kontrollen. Die Ergebnisse lassen die Aussage zu, dass IFN-β einen modulierenden Einfluss auf die De- und Remyelinisierung hat. Genau genommen besteht eine dosisabhängige Hemmung der Differenzierung von NG2-positiven Vorläuferzellen zu reifen Oligodendrozyten. Im Cuprizonemodell wiesen die IFN-β-k.o.-Mäuse eine schnellere Remyelinisierung und eine vermehrte Anzahl an OPCs in den demyelinisierten Bereichen auf. Es ist anzunehmen, dass die Wirkung von IFN-β in vitro und in vivo auf den selben Mechanismen beruht. Daher liegt die Hypothese nahe dass das Fehlen von IFN-β induzierten hemmenden Effekten auf die Differenzierung zu einer schnelleren Remyelinisierung der IFN-β-k.o.-Mäuse führt. Weiterführende Untersuchungen sind nötig, um die genauen Mechanismen von IFN-β in Verbindung mit Gliazellen während der Remyelinisierung in der Multiplen Sklerose zu verstehen.

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Heine, Sandra: Einfluss von Interferon-[beta] auf Oligodendrozyten. Hannover 2006. Tierärztliche Hochschule.

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