Comparative determination of Taenia saginata cysticercosis (Cysticercus bovis) with visual diagnosis, PCR and ELISA

Abuseir, Sameh

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Comparative determination of Taenia saginata cysticercosis (Cysticercus bovis) with visual diagnosis, PCR and ELISA

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Die Ermittlung der Prävalenz von T. saginata Zystizerkose im Rahmen der Schlachttier- und Fleischuntersuchung wird durch zwei Faktoren erschwert. Während der gesetzlich vorgeschrieben Fleischuntersuchung müssen nur so genannte „Prädilektionsstellen“ visuell auf T. saginata Metazestoden untersucht werden, obwohl Finnen auch an anderen Stellen des Tierkörpers zu finden sind. Dies kann zu einer Unterschätzung der Prävalenz von T. saginata Metazestodes führen. Parallel dazu könnte am Schlachthof die Anzahl T. saginata-Finnen-haltiger Tiere durch die Verwechslung mit anderen parasitäten Veränderungen, Zysten oder Abszessen überschätzt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die verschiedenen Faktoren, welche die Prävalenz von T. saginata Zystizerkose beeinflussen, aufzuklären. Dafür wurde eine Anwendung visueller Untersuchung der Finnen, molekularbiologische Untersuchung (PCR) und serologische Untersuchung (ELISA) von Seren und Fleischsaft-Proben, die aus infizierten und vorberichtlichen unauffälligen Tieren stammten, durchgeführt. Die Gesamtmenge von 552 Zysten, Blutproben und Fleischproben wurde in zwei norddeutschen Schlachthöfen gesammelt. Die Zysten wurden nach der morphologischen Untersuchung als Finnen von T. saginata bezeichnet. Es folgte eine makroskopische Untersuchung der Zysten, um ihre Morphologie und ihre Bestandteile zu beschreiben. Die Zysten wurden als lebensfähig (n=40) oder degeneriert (n=512) klassifiziert. Anschließend wurde DNA aus diesen Proben isoliert und molekularbiologisch (PCR) untersucht, um die morphologische Diagnose (Finne) bestätigen oder ablehnen zu können. Im Rahmen des Projektes wurden hierzu zwei Primerpaare im Hinblick auf ihre Sensitivität und Spezifität untersucht. Mithilfe des Primerpaares HDP1 konnte T. saginata-DNA ab einem Gehalt von 200 fg, und T. saginata-Metazestoden-DNA ab einem Gehalt von 100 pg nachgewiesen werden. HDP2 Primer konnten T. saginata-DNA-Gehalte ab 1pg und T. saginata-Metazestodes-DNA-Gehalte ab 1 ng nachweisen. Bei 87,5% der lebenden und 67,4% der degenerierten Finnen konnte T. saginata-DNA nachgewiesen werden. Mithilfe der Peptide HP6-2 und Ts45S-10 wurde ein ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen T. saginata-Metazestoden in Serum und Fleischsaft entwickelt. Positive Kontrollseren wurden aus experimentell infizierten Kälbern gewonnen. Die Kontroll-Fleischsaftproben wurden aus natürlich infizierten Kälbern gewonnen. Die auf den beiden Peptiden und einem Mischansatz der beiden basierenden ELISA-Systeme wurden validiert. Der Cut-off Punkt für die Serumproben für jedes benutzte Peptid wurde durch negative Serumproben (n=102) berechnet. Die Ergebnisse des ELISAs mit den verschiedenen Peptiden wurden verglichen. Sensitivität und Spezifität wurden aus einer weiteren negativen Serumpopulation (n=50) berechnet. Die Peptide HP6-2 und Ts45S-10 zeigten für Serumproben mit jeweils 100% die höchste Sensitivität und Spezifität. Das Peptid HP6-2 wurde für die Untersuchung von Serumproben aus Finnenbehafteter Tiere (n=60) und randomisierte Feldproben (n=128) angewandt, mit positiven Ergebnissen bei 91,7 bzw. 15,6% der untersuchten Proben. Für die Untersuchung von Fleischsaftproben erwies sich der auf dem Mischansatz beider Peptide basierende ELISA mit einer Sensitivität von 100% und einer Spezifität von 95,1% als am besten geeignet. Mit Hilfe dieses ELISA-Systems wurden 88 Fleischsaft-Proben Finnenbehafteter Tiere untersucht. Alle Proben erwiesen sich als positiv.

The determination of the prevalence of T. saginata cysticercosis is difficult for two reasons. The first is concerned with the traditional inspection method at the slaughterhouse. During this statutory inspection, traditional “predilection sites” for T. saginata metacestodes have to be examined visually only, even though the cysts could also be found in other sites. So concerning the location of T. saginata metacestodes the prevalence is underestimated. Parallel to that, cysts that are defined as T. saginata metacestodes at the slaughterhouse could be misdiagnosed with other parasites, cysts and abscesses in the muscles. So concerning the confusion of the cysts with other lesions the prevalence of T. saginata cysticercosis is probably overestimated. The aim of the present thesis was to elucidate the different factors influencing the determination of the prevalence of T. saginata cysticercosis using visual examination of the cysts in correlation with molecular biological examination (PCR), and with serological examination (ELISA) of the serum and meat juice of infested and non infested animals. A total of 552 cysts, blood and meat samples were collected from March 2004 to March 2006 from two main abattoirs in northern Germany. The cysts were classified by the usual organoleptic methods during meat inspection as T. saginata metacestodes. The cysts were examined macroscopically for description of their morphology and constituents and classified as viable (n=40) or degenerative (n=512). The DNA was extracted from these cysts and subjected to PCR for evaluation of the detection methods used and to confirm the diagnosis T. saginata cysticercosis as indicated at the slaughterhouses. Two sets of primers were used with different sensitivity levels. The first, HDP1, was able to detect 200 fg of T. saginata DNA and 100 pg of T. saginata metacestodes’ DNA. The other primer set, HDP2, was able to detect 1 pg of T. saginata DNA and 1 ng of T. saginata metacestodes’ DNA. 87.5% of viable cysts and 67.4% of degenerative cysts were tested positive for T. saginata metacestodes DNA. Two peptides, HP6-2 and Ts45S-10, were used as antigens for the detection of antibodies against T. saginata cysticercosis in serum and meat juice samples using ELISA. Positive control samples were obtained from animals experimentally infected (serum) and from animals naturally infected (meat juice). The two peptides and a pooled preparation of both of them were evaluated and their cut-off points using negative serum samples (n=102) were calculated. ELISA results with these different peptides were compared. Sensitivity and specificity of the peptides were calculated from a different negative serum population (n=50). The sensitivity and the specificity of HP6-2 and Ts45S-10 peptides using serum were identical, and were calculated as 100.0%, showing to be higher than the values of the pooled peptides. HP6-2 peptide was used to examine serum samples from animals with cysts (n=60) and random field serum samples (n=128), of which 91.7 and 15.6% were found positive, respectively. For meat juice samples the pooled peptides showed the highest sensitivity and specificity, as they were 100.0% and 95.1% respectively. Pooled peptides were used to examine 88 meat juice samples from animals with cysts, of which 100.0% were found positive.