Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Strukturelle, funktionelle und genetische Analyse der LEW/Ztm-ci2 Ratte

Held, Nadine

The LEW/Ztm-ci2 rat arose through a spontaneous mutation in the LEW/Ztm inbred strain in 1991. Homozygous mutants exhibit hereditary sensorineural deafness, locomotor hyperactivity and vestibular dysfunctions such as circling behaviour, ataxia, opisthotonus and an inability to swim. The symptoms are caused by a virtually complete loss of the cochlear neuroepithelium and the surrounding ganglion cells. Furthermore LEW-ci2 rats display restricted visual capability. The ci2-mutation was mapped to chromosome 10 (RNO10) by a linkage analysis of a backcross population. The primary aim of this study was to characterize the mutation that underlies the deviant phenotype of the LEW-ci2 rat. After identifying the affected gene, a comparative study of the human genome was carried out to establish a link between the ci2-mutation and the genetics of human diseases with the objective to evaluate the LEW-ci2 rat as an animal model for deafblindness. Another aim of this thesis was the characterization of the eye phenotype of the LEW-ci2 rat. By sequencing the candidate genes the ci2-mutation could be localized in the tail of the myosin XV-gene. The point mutation in Myo15 causes the substitution of an amino acid in a region of the protein that contains important binding sites for protein-protein interactions. Since a regular expression of Myo15 was found in LEW-ci2 rats it was assumed that the interaction between the myosin XV and other proteins was disturbed as a result of structural changes or changes in the folding features of the protein. Mutations in the myosin XV gene in humans are only known to be linked to hereditary deafness. However, a connection to the Usher Protein Interactom has recently been found. This macromolecular network is composed by proteins that are involved in the human Usher Syndrome. This disease exhibits a broad clinical variety and may be accompanied by congenital, sensorineural hardness of hearing or deafness, vestibular dysfunctions and a progressive loss of the visual capability. The latter is caused by a Retinopathia pigmentosa which is characterized by a degeneration of photoreceptor cells in the retina and eventually leads to blindness. The eye phenotype of the LEW-ci2 rat was analysed by a functional examination of the retina using electroretinography (ERG) as well as histological evaluations of bulbi slides. First investigations indicated a pathology that is linked to the type of housing system. In a subsequent study LEW-ci2 rats kept under various housing conditions as well as control animals of the coisogenic strain LEW were examined electrophysiologically and histologically in a comparitive manner. In addition, environmental and housing conditions of different animal rooms were compared. The aim was to prove the possible influence of those factors on the development of the retinal disease. Interestingly, the LEW-ci2 rats housed in the first unit and the controls exhibited an unaffected vision and no degenerative changes in the eyeground. The mutants of the second unit on the other hand showed moderate to severe loss in photoreceptor function caused by a severe degeneration of these cells which partially lead to a complete loss of the outer retina whilst the Retinal Pigment Epithelium remained unaltered. This pathology shows an analogy to the human Usher Syndrome. In addition to the examination of the eye phenotype of the LEW-ci2 rat the environmental and housing conditions of both animal rooms were examined in a comparative study. Differences in behaviour and weight of animals that were detected were attributed to the differing housing conditions. These differences as well as the slight differences of environmental condition of both units could not be associated with the severe changes of the eyeground of the LEW-ci2 rats of the second unit. Since the retinal phenotype of the LEW-ci2 rat depends on the housing system and homozygous as well as heterozygous LEW-ci2 rats were affected despite the fact that the mode of inheritance of the vestibulo-chochlear phenotype is autosomal recessive, environmental factors have to be involved in the origin of the eye disease. However control animals that were housed parallel to the LEW-ci2 rats did not show any symptoms. Therefore it is assumed that a genetic defect (ci2 mutation) in combination with an unknown environmental factor has caused the eye phenotype of LEW-ci2 rats. In spite of the closeness to the Usher Protein Interactome the importance of the Myosin XV in connection with the human Usher Syndrome has so far not been clarified. Thus, additional investigations have to be carried out. The LEW-ci2 rat is however still qualified to be used as a research model for syndromale deafness of humans. Further research have to be done to find out wheather the mutant strain can additionally be used as an animal model for deafblindness and and to investigate the role of genetic as well as environmental factors during the development of the eye disease.

Die LEW/Ztm-ci2 Ratte, die 1991 durch eine Spontanmutation im LEW/Ztm Inzuchtstamm entstand, ist gekennzeichnet durch neurosensorische Taubheit, lokomotorische Hyperaktivität und vestibuläre Störungen wie Rotationsverhalten, Ataxien, Opisthotonus und Schwimmunfähigkeit. Die Symptomatik wird durch einen nahezu vollständigen Verlust des sensorischen Epithels im Innenohr sowie der umliegenden Ganglienzellen verursacht. Darüber hinaus ist das Sehvermögen der LEW-ci2 Ratte eingeschränkt. Mit Hilfe einer Kopplungsanalyse an einer Rückkreuzungspopulation wurde die ci2-Mutation auf Chromosom 10 (RNO10q22) lokalisiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war in erster Linie die Charakterisierung der Mutation, die dem veränderten Phänotyp der LEW-ci2 Ratte zugrunde liegt. Im Anschluß an die Identifikation des betroffenen Gens sollte durch eine vergleichende Betrachtung des menschlichen Genoms eine Verbindung zur Genetik humaner Erkrankungen geschaffen werden, um die Möglichkeit einer Einstufung als Tiermodell für Taubblindheit zu prüfen. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Charakterisierung des Augenphänotyps der LEW-ci2 Ratte angestrebt. Mit Hilfe von Sequenzierungen der Kandidatengene wurde die ci2-Mutation in der Schwanzregion des Myosin XV-Gens lokalisiert. Den internationalen Nomenklatur-Richtlinien folgend wird die Mutante nunmehr als LEW/Ztm-Myo15ci2 Ratte bezeichnet.  Die Punktmutation im Myo15 verursacht dabei den Austausch einer Aminosäure in einem Bereich des Proteins, in dem sich wichtige Bindungsstellen für Protein-Protein-Interaktionen befinden. Da eine reguläre Expression des Gens nachgewiesen wurde, musste davon ausgegangen werden, dass die Verbindung zu Interaktionspartnern durch strukturelle Veränderungen bzw. durch Änderung der Faltungseigenschaften des Proteins gestört sind. Beim Menschen sind Mutationen im Myosin XV-Gen bisher nur im Zusammenhang mit hereditärer Taubheit bekannt. Kürzlich konnte jedoch eine Verbindung zum Usher Protein Interaktom nachgewiesen werden. In diesem makromolekularen Netzwerk sind Proteine organisiert, die an der Entstehung des humanen Usher Syndroms beteiligt sind. Klinisch ist diese Erkrankung sehr variabel und kann mit kongenitaler, neurosensorischer Schwerhörigkeit oder  Taubheit, vestibulärer Dysfunktion und einem progressiven Sehverlust einhergehen, der durch eine Retinopathia pigmentosa verursacht wird. Diese ist charakterisiert durch eine Degeneration von Photorezeptorzellen in der Netzhaut und führt letztendlich zu vollständiger Blindheit. Der Augenphänotyp der LEW-ci2 Ratte wurde über eine Funktionsprüfung der Retina mittels Elektroretinographie (ERG) sowie über eine histologische Bewertung der Netzhaut analysiert. Erste Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine von der Art des Haltungssystems abhängige Symptomatik der Tiere.  In der folgenden Studie wurden LEW-ci2 Ratten unterschiedlicher Haltungen sowie Kontrolltiere des Hintergrundstammes LEW elektrophysiologisch und histopathologisch untersucht. Ergänzend dazu wurde ein Vergleich der Haltungs- und Umweltbedingungen vorgenommen. Dadurch sollte ein möglicher Einfluss dieser Faktoren auf die Ausprägung der retinalen Erkrankung überprüft werden. Bei LEW-ci2 Ratten der ersten Haltung sowie bei Kontrolltieren waren weder Einschränkungen des Sehvermögen noch degenerative Veränderungen am Augenhintergrund nachzuweisen. Im Gegensatz dazu zeigten LEW-ci2 Ratten der zweiten Haltung einen mittel- bis hochgradigen Funktionsverlust der Photorezeptoren im ERG sowie eine starke Degeneration dieser Zellen, die teilweise zu einem vollständigen Verlust der äußeren Retina bei unverändertem Retinalen Pigmentepithel führte. Diese Symptomatik zeigt Parallelen zum humanen Usher Syndrom. Neben der Untersuchung des Augenphänotyps der LEW-ci2 Ratte wurden in der Vergleichsstudie zusätzlich die Umwelt- und Haltungsbedingungen der beiden Tierhaltungen gegenübergestellt. Unterschiede in Verhalten und Gewicht konnten auf verschiedene Haltungsbedingungen (Einzel- vs. Gruppenhaltung) zurückgeführt werden.  Diese stehen ebenso wie die lediglich geringgradigen Differenzen der Umweltbedingungen beider Haltungssystemen in keinem Zusammenhang mit den hochgradigen Veränderungen, die am Augenhintergrund von LEW-ci2 Ratten der zweiten Tierhaltung vorlagen. Da die retinale Symptomatik bei LEW-ci2 Ratten abhängig vom Haltungssystem auftrat oder fehlte und da sowohl homozygote als auch heterozygote Tiere betroffen waren, obwohl der vestibulo-cochleäre Phänotyp autosomal rezessiv vererbt wird, müssen Umweltfaktoren an der Entstehung der Augenerkrankung beteiligt sein. Parallel gehaltene Kontrolltiere zeigten jedoch keine Symptomatik. Es ist also davon auszugehen, dass ein genetischer Defekt (ci2-Mutation) zugrundeliegt, der in Verbindung mit einem bisher unbekannten Umweltfaktor den Augenphänotyp bei LEW-ci2 Tieren verursacht. Trotz der Nähe zum Usher Protein Interaktom ist die Bedeutung des von der ci2-Mutation betroffenen Myosin XV im Zusammenhang mit dem humanen Usher Syndrom bisher nicht geklärt und sollte eingehend untersucht werden. Die LEW-ci2 Ratte ist nach wie vor für die Erforschung von syndromaler Taubheit beim Menschen geeignet. Ob die Mutante zusätzlich als Tiermodell für Taubblindheit eingesetzt werden kann und welche Rolle die genetische Komponente bzw. die Umweltfaktoren bei der Ausprägung der retinalen Symptomatik spielen, muss weiter untersucht werden.

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Held, Nadine: Strukturelle, funktionelle und genetische Analyse der LEW/Ztm-ci2 Ratte. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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