Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effekte alternativer Kryoprotektiva auf die Vitalität und Chromatinintegrität tiefgefrorener Hengstspermatozoen

Hoffmann, Nicole

In response to the current discussion about alternative cryoprotectants, this study compares the amides dimethyl formamide, methyl formamide, and ethylene glycol to glycerol in terms of their effectiveness in cryopreserving stallion spermatozoa. A total of 36 ejaculates were collected from 12 fertile Hanoverian warmblood stallions (6 of them good freezers; 6 of them bad freezers) and frozen using the split-sample method. After centrifugation, sperm samples were divided and resuspended in extender INRA 82 + 2% egg yolk to aliquots of 200 x 106 sperms/ml. In order to get a final concentration of 1, 2, 3 and 4% (v/v) in the sperm suspension, the extender was modified beforehand with different levels (2, 4, 6 and 8% (v/v)) of the four different cryoprotectants. Each modified extender was then added (1:1) to each aliquot. Sperm motility parameters were assessed by means of computer video-micrography (MIKA Motion Analyzer). Membrane integrity (FITC-PNA/SYTO®17/PI-staining), acrosomal status (FITC-PNA/SYTO®17/PI-staining), membrane fluidity (merocyanine540-YoPro-assay), and sperm chromatin structure (SCSA™) were analyzed using flowcytometry (FACScan™, Becton Dickinson, Heidelberg). While an analysis of individual parameters resulted in varying concentration optima, the overall quality of frozen-thawed semen, using a concentration of 2% (v/v), proved to be optimal. In terms of motility, the results presented in this study are in agreement with ALVARENGA et al. (2000), GRAHAM et al. (2000), SQUIRES et al. (2004) and VIDAMENT et al. (2002). More than 50% of frozen-thawed spermatozoa showed progressive motility, i.e. there is no significant difference between the four cryoprotectants (p≥0,05). With regard to membrane integrity, however, sperms frozen with glycerol showed a significantly higher vitality, and the percentage of cells with an intact acrosome was higher (p≤0,05). Glycerol was also the most effective cryoprotectant in terms of membrane fluidity, demonstrating a higher capacity for preserving the ability of spermatozoa to capacitation (p≤0,05). According to the above-mentioned authors, amides and ethylene glycol are more suitable than glycerol for the cryopreservation of semen obtained from “bad freezer” stallions. The research results presented in this study challenge this theory. Even with the bad freezer stallions, the postthaw quality of semen frozen with glycerol was significantly better with regard to acrosome integrity and vitality than semen cryopreserved with methyl formamide, dimethyl formamide, and ethylene glycol (p≤0,05). As a consequence, it seems recommendable to call for a standardization of glycerol concentrations, which tend to vary widely among the various international laboratories. This would be an important step toward achieving an optimal balance between glycerol’s cryoprotective efficiency and its toxic and contraceptive effects on fertility. After all, an objective comparison of the cryoprotectants in discussion is acceptable only if optimal concentrations of all substances are used. Clearly, more extensive research is required before glycerol can be replaced as the leading cryoprotectant.

In Reaktion auf die Diskussion um alternative Kryoprotektiva wurden in der vorliegenden Arbeit die Amide Methylformamid, Dimethylformamid und der Zuckeralkohol Ethylenglykol in Hinblick auf ihre kryoprotektive Wirksamkeit mit Glycerol verglichen. In den Untersuchungen wurden 36 Ejakulate von 12 Hannoveraner Warmbluthengsten (6 Hengste mit empirisch guter Tiefgefriereignung, 6 Hengste mit empirisch schlechter Tiefgefriereignung) verwendet und im split-sample-Verfahren tiefgefroren. Im Anschluss an Samengewinnung und Zentrifugation wurden die Ejakulate bis zu einer Endverdünnung von 200 x 106 Spermien/ml mit einem Tiefgefrierverdünner (INRA 82 + 2% klarifizierter Eidotter) resuspendiert und dann mit den zu vergleichenden Kryoprotektiva versetzt. Die in der Endverdünnung gewünschten Konzentrationen aller 4 Kryoprotektiva sollten 1, 2, 3 und 4% (v/v) sein. Um die genannten, finalen Konzentrationen in der Spermiensuspension zu erreichen, wurden im Vorwege 4 modifizierte Tiefgefrierverdünner mit Konzentrationen von jeweils 2, 4, 6, und 8% (v/v) auf der Basis des zur Resuspension eingesetzten Tiefgefrierverdünners hergestellt und die split-sample eines jeden Ejakulates 1:1 mit jedem Tiefgefrierverdünner versetzt. Die Motilität wurde mittels Computervideomikrographie (MIKA Motion Analyser), die Membranintegrität (FITC ‑ PNA/SYTO®17/PI ‑ Färbung), der akrosomale Status (FITC ‑ PNA/SYTO®17/PI ‑ Färbung), die Spermienchromatinstruktur (SCSA™) und die Membranfluidität (Merocyanin540/YoPro ‑ Färbung) wurden mittels Durchflusszytometer (FACScan™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) analysiert und als Beurteilungskriterien eingesetzt. Obwohl die Betrachtung einzelner Parameter unterschiedliche Teilergebnisse liefert, erweist sich im Gesamtbild der Einsatz einer 2% (v/v), finalen Konzentration für alle Kryoprotektiva in Hinblick auf maximale Samenauftauqualitäten als optimal. Im Parameter Motilität entsprechen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit denen von ALVARENGA et al. (2000), GRAHAM et al. (2000), SQUIRES et al. (2004) und VIDAMENT et al. (2002). Die Vorwärtsbeweglichkeit der verglichenen Kryoprotektiva liegt nach dem Auftauen bei >50%; es besteht kein signifikanter Unterschied zwischen den Kryoprotektiva (p≥0,05). In den Parametern der Membranintegrität jedoch sind die mit Glycerol eingefrorenen Spermien signifikant vitaler und erleiden im Vergleich die geringsten akrosomalen Verluste (p≤0,05). Auch der Parameter Membranfluidität verdeutlicht die im Vergleich zu Methylformamid, Dimethylformamid und Ethylenglykol signifikante Überlegenheit Glycerols, die Fähigkeit kryokonservierter Spermien zur Kapazitation zu erhalten (p≤0,05). Zuvor genannte Autoren behaupten, dass Amide und Ethylenglykol Glycerol vor allem bei der Kryokonservierung von Hengstsperma mit empirisch schlechter Tiefgefrierereignung überlegen sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit widersprechen dieser Theorie. Selbst in der Gruppe der Hengste mit empirisch schlechter Tiefgefriereignung war die Samenauftauqualität der mit Glycerol eingefrorenen Spermien in den Parametern Akrosomintegrität und Vitalität signifikant besser als die der mit Methylformamid, Dimethylformamid und Ethylenglykol kryokonservierten Spermien (p≤0,05). Abschließend erscheint es sinnvoll, eine Standardisierung der unter den verschiedenen internationalen Labors stark variierenden Glycerolkonzentration zu fordern, um maximale Samenauftauqualitäten und eine Reduktion der toxischen und kontrazeptiven Eigenschaften zu erreichen. Denn nur auf der Grundlage optimaler Konzentrationen der zur Diskussion stehenden Kryoprotektiva lassen sich diese objektiv miteinander vergleichen. Offensichtlich besteht weiterer Forschungsbedarf, bevor Glycerol begründet aus seiner Vormachtstellung verdrängt werden kann.

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Hoffmann, Nicole: Effekte alternativer Kryoprotektiva auf die Vitalität und Chromatinintegrität tiefgefrorener Hengstspermatozoen. Hannover 2007. Tierärztliche Hochschule.

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